牛外周血淋巴细胞PD-1胞外区基因的原核表达及多抗制备

• 作者: 刘珊珊 吴陈华 刘宇 赵尚琪 赫鸣睿 王丽 王天 何泊宁 张世勋 岳山 黄雯静 朱战波
• 来源期刊: 中国生物制品学杂志
• 学科: 农学
• 关键词: 程序性细胞死亡蛋白-1 牛 PD-1胞外区 原核表达 多克隆抗体
• 年，卷（期）: 2021,（1）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 32-37
• 页数: 6页
• 分类号: S852.4
• 语种: 中文

摘要

目的 原核表达牛外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes,PBL)表面程序性细胞死亡蛋白-1(programmed cell death protein 1,PD-1),并制备其多抗血清.方法 以PBL的cDNA为模板扩增牛PD-1胞外区片段,与载体pET-28a(+)连接,构建重组质粒pET-28a-PD-1,并进行生物信息学分析;重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),经不同浓度的IPTG诱导表达牛PD-1 胞外区重组蛋白(简称牛PD-1 蛋白),产物进行SDS-PAGE 及Western-blot 分析;纯化的目的蛋白免疫小鼠制备血清多抗,与CP、NCP型牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)体外孵育牛PBL 72 h,检测BVDV 病毒拷贝数.结果 经双酶切及测序鉴定,重组质粒pET-28a-PD-1 构建正确;牛PD-1 胞外区基因读码框编码147 个氨基酸,相对分子质量约为16 040,其二级结构主要由a螺旋、延伸链、无规则卷曲构成,与人及鼠序列的同源性分别为79％和71％;在37℃,0.8 mmol/L IPTG诱导条件下,牛PD-1蛋白相对分子质量约19 000,以包涵体的形式表达;制备的多抗血清效价最高为1∶102 400,能与目的蛋白发生特异性反应,显著降低CP、NCP 型BVDV 病毒拷贝数(P＜0.05).结论 成功构建了重组表达质粒pET-28a-PD-1,获得了牛PD-1 蛋白及其多抗血清,且免疫原性较好,PD-1 阻断抑制BVDV 在PBL细胞中的复制,为开发具有调节及治疗慢性病毒感染的生物制品奠定基础.