布鲁氏菌微滴式数字PCR方法的建立与应用

• 作者: 田国忠 姜海 薛盼盼 朴东日 赵鸿雁 杨晓雯 张京云
• 来源期刊: 中国人兽共患病学报
• 关键词: 微滴式数字PCR 荧光定量PCR 布鲁氏菌
• 年，卷（期）: 2021,（4）
• 所属期刊栏目: 论著|Original Articles
• 页码范围: 301-305
• 页数: 5页
• 分类号: R378.5
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.040

摘要

目的 建立可对布鲁氏菌准确定量的微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)方法.方法 使用以布鲁氏菌bscp 31基因为靶标的引物和探针,摸索最佳的引物和探针工作浓度,确定反应体系和扩增条件,评价所建立方法的灵敏性、特异性及对疫情相关血液标本的检测效果.结果 ddPCR反应体系中最佳引物和探针浓度分别为0.8 μmol/L和0.4μmol/L;最佳扩增条件:95℃10 min;95℃30 s,60℃1 min,循环40次;98℃酶失活10 min.布鲁氏菌核酸DNA为0.96 ng/反应～3.68 fg/反应时,ddPCR检出靶标基因拷贝数为2.00×105拷贝/反应～1拷贝/反应,ddPCR测得值的对数值与DNA浓度的对数值有线性关系.在疫情相关血液标本DNA的检测中,ddPCR阳性率远高于培养法和试管凝集法;16份人血液标本中靶标基因浓度为5～65拷贝/mL血液(平均29拷贝/mL血液),5份羊血液标本中靶标基因浓度为25～245拷贝/mL血液(平均98拷贝/mL血液).结论 ddPCR灵敏性高,可检测微量核酸DNA,适合临床血液标本的检测以及布病病原体的分子流行病学调查.