摘要:

根据GenBank公布的布鲁氏菌Bcsp31、牛分枝杆菌pncA、炭疽杆菌capA三种特异基因的保守序列分别设计引物,在引物前添加通用引物(Tag),建立3种奶牛常见病菌的多重实时荧光定量PCR方法;通过构建3种病菌PCR扩增目的基因的质粒用于制备标准品进行敏感性验证;利用大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌用于特异性试验,并对30份样本进行了检测.结果表明,本研究构建的多重实时荧光定量PCR检测时间仅需2h,灵敏度为100个拷贝/uL,与其它细菌无交叉反应,特异性为100％,阳性检出率为88.89％.因此,本试验成功建立了检测3种奶牛常见病菌早期诊断的方法,可以在奶牛养殖中应用.

摘要:

根据欧洲型N基因、美洲型M基因和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV) nsp2基因的各自保守序列设计特异性的引物和不同荧光标记的TaqMan荧光探针,通过优化反应体系和扩增条件,建立了能够检测欧洲型、美洲型和高致病性PRRSV的多重实时荧光定量PCR方法.该方法的重复试验表明其批内和批间的变异系数最高值分别为1.84％和1.76％;灵敏性试验表明其检测下限为10 copies/μL;特异性试验表明与其他一些猪源病毒无交叉反应,具有良好的特异性;临床试验表明,该方法能够快速准确地检测出临床组织样本中美洲型及高致病性PRRSV的核酸;此外,本研究用欧洲型PRRSV质粒进一步验证了该方法可以检测出欧洲型PRRSV的目的基因.该方法的建立为不同类型的PRRSV快速检测提供了有效手段,可用于猪繁殖与呼吸综合征疫情的监测及防控.

摘要:

本研究以16S rRNA基因作为靶基因,利用TaqMan探针技术建立了针对志贺氏菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)三种主要食源性致病菌的多重实时荧光定量PCR检测技术.结果表明,建立的荧光定量PCR检测体系特异性良好、灵敏度高、简便快捷,大大缩短了检测时间,在食源性致病菌快速筛查方面具有良好的应用前景.

摘要:

目的：将多重实时荧光定量PCR技术与裸磁珠富集技术联用，建立辣椒样品中常见3类（曲霉属、青霉属、镰刀菌属）产毒性真菌的快速定量检测方法。方法根据真菌核糖体RNA（rDNA）基因序列选择真菌广谱引物及属特异性探针，联用裸磁珠富集技术，建立多重实时荧光定量PCR体系，并评价所建方法的灵敏度、特异性、重复性和一致性。结果裸磁珠-多重实时荧光定量PCR方法灵敏度高，与本研究优化后的普通实时荧光定量PCR相比提高了10倍，是原报道的100倍，直接检测辣椒样品中3类产毒性真菌的检出限均可达103 CFU/ml，即104 CFU/g，且特异性良好（与非目标菌无交叉反应）、重复性良好（CV<1.5%），该方法模拟检测辣椒样品中3类产毒性真菌的计数结果与标准培养法的计数结果相比均无统计学差异（P>0.05），实验过程仅需7 h（标准培养鉴定法耗时7~14 d）。结论构建的裸磁珠-多重实时荧光定量PCR方法能大大缩短产毒性真菌的检测时间，并成功应用于模拟辣椒样品中常见3类产毒性真菌的定量检测，值得进一步研究和推广。

摘要:

目的 为了判定霍乱弧菌是否携带相关毒力因子,研发一种快速、准确、特异检测霍乱弧菌3种毒素基因的多重荧光定量PCR方法.方法 针对霍乱弧菌ctxA、ace、zot基因设计引物和探针,建立PCR体系,对70株霍乱弧菌分离株进行鉴定,采用直接测序方法对鉴定结果进行验证.结果 建立的多重实时荧光定量PCR方法可同时准确、特异地鉴定霍乱弧菌菌体携带的3种毒素基因,不携带毒素基因的菌株均未出现阳性检测结果.菌体检测的最低检出限度ctxA基因:102 CFU/mL,ace基因和zot基因:10 CFU/mL.构建了3种毒素相关基因阳性质粒,ace基因和zot基因的最低检出限度为10 copies/μL,ctxA基因的最低检出限度为102 copies/μL,定量检测批间和批内的变异系数均小于5％；对70株霍乱弧菌分离株进行评价,结果显示其中40株(57.2％)携带ctxA毒素基因、31株(44.3％)携带ace毒素基因、46株(65.7％)携带zot毒素基因,通过测序方法验证,符合率达到100％.结论 本文建立的多重实时荧光定量PCR方法操作简便、特异性好、灵敏度高,为霍乱弧菌的现场流行病学调查和疫情监测提供了快速、可靠的鉴定工具.

摘要:

[目的]采用多重实时荧光定量PCR方法在一个反应内同时检测转基因烟草中插入外源基因35S、NOS、NPT Ⅱ的拷贝数.[方法]将转基因阳性参照烟草基因组DNA经梯度稀释,通过多重荧光定量PCR反应同时获得烟草内源参照基因NR、外源基因35S、NOS、NPT Ⅱ的相关性标准曲线方程,将待测株系外源基因的Ct值代入标准曲线方程后估算其拷贝数.[结果]获得了上述4个基因的标准曲线,其R2均接近于1,相关性较高.在检测的六个转基因株系中初筛到3株3个外源基因均为单拷贝的株系.[结论]可使用该方法对转基因烟草外源基因插入拷贝数进行估算,为获得稳定遗传材料提供初筛依据.