摘要:

目的 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达兔轮状病毒VP7基因.方法 根据GenBank发表的LaRV 308/01 VP7基因序列(AF5028201),设计一对特异性引物,RT-PCR扩增获得VP7基因,将目的 片段克隆入pFastBacHTa中,构建重组转移载体6pFastBHa-VP7.将重组转移载体转化DH10Bac感受态细菌,与Bacmid发生位点特异性转座作用,获得重组穿梭载体Bacmid-VP7,通过脂质体将其转染昆虫细胞Sf9.结果 获得了重组杆状病毒Bacmid-VP7,Westernblot和IFA分析表明VP7蛋白在昆虫细胞中获得正确表达且表达产物具有抗原性.结论 本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达兔轮状病毒VP7蛋白,为进一步建立诊断学方法奠定了实验基础.

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目的 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达小鼠肝炎病毒N基因. 方法 根据GenBank发表的小鼠肝炎病毒A59株N基因序列(AY700211),设计一对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增出N基因的ORF,将目的 片段克隆入pFastBacHTa中,构建重组转移载体pFastBHa-N.将重组质粒转化DH10Bac感受态细菌,与Bacmid发生位点特异性转座作用,获得重组穿梭载体Bacmid-N.通过脂质体将其转染昆虫细胞Sf9. 结果 获得了重组杆状病毒rBN,并通过Westernblot和IFA分析表明证实N蛋白在昆虫细胞中获得正确表达,且表达产物具有抗原性. 结论 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达了小鼠肝炎病毒N蛋白,为进一步进行建立诊断学方法的研究奠定了基础.

摘要:

为表达具有天然构象的蓝舌病病毒血清l型(BTV1)主要结构蛋白VP2、VP3、VP5和VP7,研制针对流行于我国的BTV1型毒株的病毒样颗粒(virus-like particles,VLP)疫苗提供基础,将编码BTV1VP2和VP5蛋白的基因分别克隆到双表达载体pFastBacDual的启动子pPH和pP10下游,构建重组质粒pFastBacDual-BTV1-VP2-VP5,将重组质粒转化DH 10Bac感受态细胞,获得重组穿梭质粒rBaemidBTV 1-VP2-VP5,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacBTV 1-VP2-VP5;按照同样策略,制备重组杆状病毒rBacBTV 1-VP3-VP7.使用兔抗BTV1-VP5蛋白多克隆抗体和鼠抗BTV-VP7蛋白单克隆抗体,分别对rBacBTV1-VP2-VP5和rBacBTV 1-VP3-VP7感染的Sf9细胞进行间接免疫荧光试验(IFA)检测,结果病毒感染细胞可见特异性荧光出现;使用兔抗BTV1-VP2蛋白多克隆抗体和兔抗BTV1-VP3蛋白多克隆抗体,分别对rBacBTV 1-VP2-VP5和rBacBTV 1-VP3-VP7感染的Sf9细胞进行Western-blot检测,可见相对分子质量约100 kDa左右的条带,大小与预期相符.IFA检测和Western Blot检测结果显示,BTV1 VP2、VP3、VP5和VP7蛋白均得以表达,且具有良好的反应原性.

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采用RT-PCR方法扩增了番鸭呼肠孤病毒S14株σC蛋白编码基因,将其克隆到pFastBacHTA载体上,经酶切鉴定及测序,筛选出阳性重组载体pFastBacHTA-σC;将pFastBacHTA-σC转化到DH10Bac感受态细胞中,通过蓝白斑和PCR筛选,获得重组转座子rBacmid-σC.在脂质体介导下将rBacmid-σC转染sf-9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBV-σC;SDS-PAGE和Western-blot分析表明,在sf-9细胞中表达了分子质量约37 ku的σC蛋白,该蛋白能与原核表达的σC蛋白免疫小鼠血清发生特异性免疫反应,这为以表达的σC蛋白为抗原的亚单位疫苗的研制奠定了基础.

摘要:

为研究重组猪肺表面活性蛋白A(RpSP-A)的抗病毒活性,采用Bac to-Bac系统对RpSP-A蛋白进行表达.首先PCR扩增目的基因并将其克隆至pFastBac1转移载体获得pFast-SP-A,通过转化DH10Bac感受态细胞获得重组Bacmid,然后转染sf9细胞获得重组杆状病毒rBV-SP-A,在sf9细胞上进行目的蛋白的表达,经镍柱纯化、脱盐柱处理后,采用蚀斑减少方法评价RpSP-A对PRRSV感染Marc-145细胞的抑制作用.结果显示RpSP-A在sf9细胞中得到正确表达,并且能够降低PRRSV在Marc-145细胞上的感染,补加Ca2+时30 μg/mL RpSP-A抑制率高达77％,15μg/mL RpSP-A抑制率为43％,未补加Ca2+时RpSP-A没有表现出抑制作用.上述结果表明利用Bac-to-Bac系统可以稳定获得大量具有抗PRRSV作用的可溶性RpSP-A.

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应用DNAStar软件,参照Genbank中注册的AIV H5亚型毒株NS1基因序列,设计了一对引物,用RTPCR方法成功地扩增出带双酶切位点的H5亚型AIV的NS1基因,通过BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切位点将H5NS1基因插入转移质粒裁体pFastbac HTa中,获得重组转移载体pFastbac HTa-H5NS1并将其转化DH10 Bac细胞,与Bacmid发生位点特异性转座作用,得到重组穿梭载体Bacmid-H5NS1,再将其转染昆虫细胞High Five,PCR鉴定证实该基因正确地插入到病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下游,经过SDS-PAGE和Western Blot检测,NS1基因在High Five细胞中得到了表达,H5NS1大小约为28kD,而且表达的产物具有特异免疫学反应性.

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为了研制一种有效控制猪流行性腹泻的疫苗,本试验设计了两对引物,分别扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)主要抗原表位S1(S蛋白中一个有效的抗原位点)和M蛋白的基因.将两段基因克隆到杆状病毒双表达载体pFastBacTMDuai中,构建了重组转移质粒pFBD-S1-M,并将其转化至DH10BacTM感受态细胞中制备重组穿梭质粒Bacmid-S1-M,转染Sf9昆虫细胞后,拯救出能够共表达S1和M蛋白的重组杆状病毒rBacmid -S1-M.表达产物经过SDS-PAGE和Western blot检测,共表达的重组S1和M蛋白产物能够与PEDV多克隆抗体发生特异性反应,表明共表达的蛋白具有良好的反应原性.本研究为PEDV基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础.

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通过反向遗传操作技术开发出了防制H5N1亚型高致病力禽流感并能区分疫苗免疫和自然感染个体的重组H5N3 DIVA疫苗;为了建立配套诊断方法,通过杆状病毒表达系统表达了N3亚型禽流感病毒的NA蛋白.Western blotting和ELISA分析表明,表达的NA蛋白具有良好的抗原活性及特异性.NA蛋白的成功表达为重组H5N3 DIVA疫苗的配套鉴别诊断试剂盒的研制以及该疫苗的推广与应用奠定了基础.

摘要:

利用昆虫杆状病毒表达系统,成功地对埃博拉( EBOV)扎伊尔型病毒和马尔堡病毒(MARV)的NP基因进行表达.Western blot结果显示,重组EBOV蛋白和重组MARV-NP与各自阳性血清有特异的反应原性,在血清学上无交叉反应.IFA检测感染重组昆虫杆状病毒的Sf9细胞表明,EBOV和MARV NP获得大量表达,呈现强烈的荧光,对照组细胞无特异荧光.该研究为EBOV和MARV流行病学调查和研制诊断试剂盒奠定了基础.

摘要:

根据猪繁殖与呼吸综合症病毒已知序列(ch-1a,AY032626)设计包含完整ORF5序列的1对引物,采用RT-PCR方法扩增PRRSV甘肃LZH株的ORF5基因,将其克隆到杆状病毒载体pFastBacHTA上,经酶切鉴定、PCR鉴定筛选出阳性重组转移载体pFastBacHTA-ORF5,并对阳性质粒进行测序及序列分析;将pFastBacHTA-ORF5转化到DH10Bac感受态细胞中,与Bacmid发生位点特异性转座作用,获得重组转座子rBacmid-ORF5;并成功构建了PRRSV LZH株ORF5基因的杆状病毒载体,为基因工程疫苗的研制奠定了基础.