摘要:

目的 将乙型脑炎病毒NS1蛋白基因克隆至pET28-a(+)表达载体,构建原核表达载体pET-NS1,并使该基因在E.coli中高效表达,为进一步研制乙脑早期诊断试剂奠定基础.方法 根据GenBank中提供的乙型脑炎病毒SA14-14-2株全基因序列设计引物,通过反转录及巢式PCR方法扩增目的片段,测序后连接pET28-a(+)载体,构建重组表达载体pET-NS1,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,利用IPTG诱导获得高效表达.结果 扩增出了1300bp的基因片段,与预期大小一致,测序后经Blast验证与已发表乙型脑炎病毒SA14.14-2株NS1蛋白基因序列同源性为100%,成功克隆至表达载体pET28-a(+)并获得高效表达,表达产物分子量约为45kD,Western blot分析表明该表达产物具有良好抗原性.结论 该表达产物的稳定高效表达及其抗原特异性为乙脑的诊断试剂开发提供了依据.

摘要:

目的 研究HCV NS3对人肝细胞磷酸化酪氨酸相关蛋白表达的影响.方法 通过脂质体稳定转染分别建立表达HCV NS3蛋白的pReHCNS3/QSG细胞,空白质粒转染细胞pRcCMV/QSG.用Western Blot和免疫细胞化学分别检测磷酸化p44/42,磷酸化p38,磷酸化SAPK/JNK在pRcHCNS3/QsG细胞和pReCMV/QSG细胞及未转染的QSG7701细胞的表达差异及细胞内的定位;免疫共沉淀实验检测HCV NS3对磷酸化酪氨酸蛋白表达水平的影响.结果 pReHCNS3/QSG细胞,pRcCMV/QSG细胞,未转染的QSG7701细胞抽提的总蛋白中均可检测出磷酸化p44/42,磷酸化p38,磷酸化SAPK/JNK的表达,阳性信号定位于细胞核.上述3种蛋白在pRcHCNS3/QSG细胞的表达较pRcCMV/QSG细胞和未转染的QSG7701细胞表达增强,其磷酸化酪氨酸蛋白的表达也较其他两对照组增强.结论 HCV NS3可能通过影响酪氨酸蛋白激酶的表达及活性,使一系列受酪氨酸蛋白激酶调节的蛋白质如MAPK分子异常磷酸化而活化,激活下游信号转导通路,导致肝细胞无限增殖和肿瘤形成.

摘要:

登革病毒感染可引起登革热及登革出血热/登革休克综合征,是热带与亚热带地区重要的公共卫生问题.登革病毒非结构蛋白NS1 (nonstructural protein 1),在病毒感染、复制及病理过程中起着重要作用.该文综述了近年来登革病毒非结构蛋白NS1结构与功能的研究进展.

摘要:

目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白5B(HCV NS5B)转染细胞差异表达cDNA消减文库,克隆HCV NS5B蛋白反式激活相关基因.方法:以HCV NS5B表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5B转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,进行抑制性消减杂交(SSH)分析.随机挑取克隆进行测序及同源性分析.结果:文库扩增后得到35个阳性克隆,经菌落PCR分析显示其中26个克隆含有大小不等的200～1000 bp插入片段.测序及同源性分析,显示16种已知基因编码蛋白和1种未知功能基因序列,包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因,可能是NS5B反式激活靶基因.结论:成功构建了HCV NS5B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,为进一步阐明HCV NS5B反式调节的靶基因在肝炎、肝纤维化和肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据.

摘要:

目前认为丙型肝炎病毒(HCV)的非结构蛋白5B(NS5B)是病毒复制酶,但是对其生物学特性还不十分清楚,我们应用酵母双杂交系统3,构建NS5B诱饵质粒,转化酵母AH109,与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合,于涂有X-α-gal营养缺陷型培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)上筛选生长.挑选蓝色克隆,筛选出33个与NS5B特异性相互作用的克隆,其中有31个已知功能基因及2个未知功能基因.所克隆到的基因对以后研究NS5B的功能有一定的提示作用,并为研究这些能与NS5B相互作用的基因在肝细胞中的生理功能奠定了基础.

摘要:

目的 重组表达登革1型病毒NS1蛋白并制备多克隆抗体.方法 通过RT-PCR扩增编码登革1型病毒NS1蛋白的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)后经酶切测序鉴定,获得重组质粒pET-NS1.进一步使用IPTG诱导表达,经免疫印迹鉴定后,采用蛋白浸提方法从SDS-PAGE胶中纯化回收融合蛋白,并通过透析对目的蛋白进行复性;纯化复性后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光法测定抗体效价.结果 成功构建了高效表达登革1型病毒 NS1蛋白的原核表达载体,表达的重组NS1蛋白占菌体蛋白总量的50%以上,以包涵体形式存在;免疫印迹表明表达的重组NS1蛋白能够为登革病毒兔抗血清识别,纯化后纯度可达95%以上;免疫小鼠后获得了效价>1:1 000的抗登革病毒NS1蛋白的鼠多克隆抗体.结论 原核表达的重组NS1蛋白具有良好的免疫原性,诱导产生的多克隆抗体能够有效识别天然NS1蛋白,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体的生物学功能奠定了基础.

摘要:

目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)1b型的非结构蛋白3(NS3)区与原发性肝癌(HCC)的关系.方法:将患者分为丙型肝炎病毒携带者组、非HCC组及HCC组,从患者血清中提取HCV-RNA,采用巢式聚合酶链法(nested-PCR)进行HCV基因分型并扩增HCV-NS3片段,分析HCV-NS3区片段的核苷酸序列、氨基酸序列、蛋白质二级结构.结果:3组均以1b型为主,3组间1b型所占百分率比较差异无显著性(P＞0.05);3组核苷酸序列同源性95%,3组氨基酸序列的同源性为95%,且3组在NS31027-1206区间都无特殊的氨基酸突变;NS31027-1206区的蛋白质二级结构分为A、B 2型,携带组及非HCC组以A型为主,而HCC组以B型为主;携带组与非HCC组蛋白质二级结构分型差异无显著性(P＞0.05),而HCC组与携带组、非HCC组之间差异有显著性(P＜0.01).结论:1b型HCV携带者及非HCC患者与HCC患者在蛋白质二级结构上有差异,HCV-NS3与HCC的发生有关联.

摘要:

目的:筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4A(NS4A)反式激活新型靶基因.方法:以HCV NS4A蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-NS4A转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析.分析筛选得到的克隆,其中之一与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性,通过序列同源性比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.从转染pcDNA3.1(-)-NS4A的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析.结果:该新基因的编码序列全长为963个核苷酸(nt),编码产物由321个氨基酸残基(aa)组成,并测序证实,命名为NS4ATP1,在GenBank中注册,注册号为AY 740521.结论: 分子生物学技术与生物信息学技术相结合,发现并鉴定、克隆了HCV非结构蛋白反式激活作用的新型靶基因NS4ATP1,为进一步研究HCV非结构蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础.

摘要:

目的筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS4A结合蛋白,为HCV致病机制的研究探索新的途径.方法应用噬菌体展示技术,以HCV非结构蛋白NS4A作为固相筛选分子,对T7噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"的筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,最后对所筛选克隆进行DNA序列测定和同源性分析.结果噬菌体经富集后,从随机挑选的12个克隆中得到2个阳性克隆,成功构建了克隆载体.序列测定后经过序列同源性分析,确定了与HCV非结构蛋白NS4A结合的是肝细胞蛋白-丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)激活蛋白激酶5(MAPKAPK5).结论用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到了HCV非结构蛋白NS4A的结合蛋白,为进一步研究HCV的致病机制奠定了良好的基础.

摘要:

目的 探讨日本脑炎病毒抑制IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路过程中发挥关键作用的病毒特异蛋白,为阐明日本脑炎病毒抑制Ⅰ型IFN介导的JAK-STAT信号转导通路的作用机制奠定基础.方法 分别构建日本脑炎病毒编码的7种非结构蛋白基因(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5)的重组真核表达载体.采用间接免疫荧光法和Western blotting观察它们在细胞内的表达及定位情况.利用含萤火虫荧光素酶(Luc)报告基因的重组载体pISRE-Luc,观察表达病毒不同非结构蛋白的细胞内IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路的活化程度.构建融合表达红色荧光蛋白的STAT 1重组真核表达载体pRed-STAT 1,利用该重组载体在表达病毒非结构蛋白的细胞内观察融合蛋白Red-STAT 1在IFN-α作用下的细胞内定位情况.同时,对表达病毒非结构蛋白的细胞内IFN-α介导的STAT 1分子的磷酸化水平进行检测.结果 日本脑炎病毒的7种非结构蛋白均可在哺乳动物细胞内正确表达,而且表达蛋白均位于细胞质中.在这7种非结构蛋白中,NS5可阻断STAT 1分子的核转运及抑制STAT 1分子的磷酸化水平,从而抑制IFN-α介导的细胞内JAK-STAT信号转导通路的活化.结论 日本脑炎病毒的非结构蛋白NS5棚IFN系统的信号转导通路具有显著的抑制作用,可能是一种Ⅰ型IFN系统的拮抗蛋白.