小鼠Wnt-3a基因真核表达载体的构建及其在cos-7细胞中的表达

• 作者: 华兴一 尹宗生 张胜权 张辉 李光武 王伟 胡勇 陈斌
• 来源期刊: 中国临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: Wnt-3a 载体 克隆 序列分析 基因表达
• 年，卷（期）: 2005,（41）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 29-31
• 页数: 4页
• 分类号: R349.64
• 字数: 5650字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2005.41.014

摘要

目的:克隆小鼠胚脑中Wnt-3a基因片段,构建pSecTag2/Hygro B-Wnt3a真核表达载体,观察其在cos-7细胞中的表达,为基因治疗脊髓损伤提供实验依据.方法:实验于2004-09/2005-03在安徽医科大学分子生物学实验室完成.选取清洁级孕13.5 d的KM小鼠1只,脱颈处死,冰冷条件下迅速取出胚鼠,解剖显微镜下剥离胚脑,在无RNA酶污染的条件下迅速提取胚脑总RNA.利用反转录聚合酶链方法扩增小鼠胚脑Wnt-3a基因片段,将该基因片段克隆入T载体,聚合酶链反应法筛选并测序,双酶切后构建重组真核表达载体pSecTag2/Hygro B-Wnt3a.转染并筛选稳定表达的cos-7细胞,Western blot鉴定重组Wnt-3a蛋白的表达.结果:①反转录聚合酶链反应获得目的基因小鼠Wnt-3a cDNA:自胚鼠脑组织总RNA经反转录聚合酶链反应扩增后,凝胶电泳可见约1.1kb的特异性扩增片段,与预期获得产物大小相符.②pMD18-T/Wnt3a克隆质粒聚合酶链反应初步筛选与测序:测序报告所克隆的Wnt-3a为1 058 bp,通过Blast同源性分析,与GeneBank收录的序列一致,克隆小鼠Wnt-3a基因获得成功.③真核表达载体pSecTag2/Hygro B-Wnt3a的双酶切及测序:随机挑选10个克隆,聚合酶链反应扩增筛选出阳性克隆5个,经XhoⅠ和HindⅢ双酶切鉴定、测序及Blast分析鉴定重组质粒构建成功.④Western Blot鉴定重组小鼠Wnt-3a蛋白在cos-7细胞中的表达:脂质体转染cos-7后48 h,Western Blot鉴定出在细胞内存在Wnt-3a蛋白的表达,转染pSecTag2/Hygro B-Wnt3a的cos-7细胞裂解液在45KD处出现阳性条带,而培养上清中未能检测到蛋白的表达.结论:小鼠胚脑Wnt-3a基因的真核表达载体pSecTag2/Hygro B-Wnt3a构建成功,转染cos-7细胞后能够表达重组Wnt-3a蛋白.