嵌合分子CblN/Grb2构建及其原核表达

• 作者: 刘娜 刘新平 张健 李霞 王立峰 药立波
• 来源期刊: 解放军医学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 重叠延伸PCR 重组融合蛋白质类 泛素蛋白连接酶类 Cbl蛋白
• 年，卷（期）: 2006,（2）
• 所属期刊栏目: 实验研究
• 页码范围: 128-131
• 页数: 4页
• 分类号: R34
• 字数: 4633字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:0577-7402.2006.02.015

摘要

目的构建CblN/Grb2嵌合分子,表达和纯化GST-CblN/Grb2融合蛋白,并考察嵌合分子CblN/Grb2在体外是否具有泛素连接酶活性.方法提取SKBR-3细胞的总RNA并反转录为cDNA,作为模板用PCR扩增Grb2基因的SH2片段;含有人全长Cbl cDNA的质粒pEFHACbl 作为模板扩增Cbl基因N-端(CblN); 用重叠延伸PCR方法,在CblN 内部SH2两端引入BamH Ⅰ和EcoR V酶切位点并克隆入pcDNA3.1(+).再以Grb2基因的SH2置换CblN 的SH2即成为pcDNA3.1(+)-CblN/Grb2;以其为模板,通过PCR方法扩增CblN/Grb2并将其亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达GST-CblN/Grb2融合蛋白并用Glutathione Sepharose 4B进行纯化;通过体外泛素化实验检测GST-CblN/Grb2是否具有泛素连接酶活性.结果成功构建了pGEX-4T-2-CblN/Grb2融合表达载体;在大肠杆菌DH5α中表达了GST-CblN/Grb2融合蛋白并获得了纯化蛋白; 体外泛素化实验表明GST-CblN/Grb2具有泛素连接酶活性.结论 GST-CblN/Grb2 的表达、纯化及其体外活性的鉴定为进一步研究该嵌合泛素连接酶对HER2阳性肿瘤细胞生长的影响奠定了基础.