谷氨酸脱羧酶65片段与IL-10双基因真核表达载体的构建与鉴定

• 作者: 周智广 周鹏程 孙意 张松 彭健 黄干
• 来源期刊: 中国医药生物技术
• 学科: 医学
• 关键词: 谷氨酸脱羧酶 白细胞介素10 疫苗,DNA 糖尿病,1型
• 年，卷（期）: 2007,（2）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 105-109
• 页数: 5页
• 分类号: R3
• 字数: 3502字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2007.02.014

摘要

目的 优化以往构建的以预防1型糖尿病为目的的全长谷氨酸脱羧酶(GAD)65 DNA疫苗,尝试构建GAD 65片段与IL-10双基因真核表达载体.方法 从GAD65质粒中扩增出GAD190-315片段和GAD490-570片段的cDNA,以overlap PCR法将之分别与hIL-2信号肽cDNA拼接,得到SGAD190-315、SGAD490-570融合基因.以p43.2-mIL-10质粒为模板,用PCR方法扩增出IL-10基因.将SGAD190-315、SGAD490-570融合基因分别与IL-10基因依次克隆入双启动子真核表达载体pBudCE4.1中,构建出2种双基因重组真核表达载体pBud-SGAD190-315/IL-10和pBud-SGAD490-570/IL-10.2种重组真核表达载体经测序鉴定正确后,用脂质体介导的方法转染COS-7细胞,转染后48和72 h以蛋白质印迹法检测细胞裂解产物及上清液中SGAD190-315和SGAD490-570融合基因的表达,ELISA方法检测细胞上清液中IL-10的表达.结果 核酸序列测定表明克隆的SGAD190-315、SGAD490-570融合基因和IL-10基因序列与报告序列一致.蛋白质印迹法和ELISA方法均检测到SGAD190-315/IL-10和SGAD490-570/IL-10重组真核表达载体在COS-7细胞中的表达.结论 成功构建了2种GAD65片段与IL-10双基因真核表达载体,为1型糖尿病的基因疫苗预防研究提供了实验基础.