小鼠半胱天冬酶-12特异性小干扰RNA真核表达载体的构建及鉴定

• 作者: 俞红 刘芸野 周霞秋 姜山 林兰意 王晖 谢青 郭清 金由辛
• 来源期刊: 中华传染病杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 内质网应激 细胞凋亡 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 RNA干扰
• 年，卷（期）: 2007,（2）
• 所属期刊栏目: 基础论著
• 页码范围: 67-71
• 页数: 5页
• 分类号: R5
• 字数: 4162字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/j.issn:1000-6680.2007.02.002

摘要

目的 构建小鼠半胱天冬氨酸蛋白酶12(Caspase-12)基因特异性小干扰RNA(siRNA)表达载体并检测其表达.方法 参照siRNA模板设计原则,设计并合成3对针对caspase12不同位点的siRNA,分别在脂质体介导下转染小鼠肝癌细胞株Hepal-6,24 h收集细胞;RT-PCR分析不同位点siRNA对靶基因mRNA表达的抑制,筛选出抑制效率最高的位点;将此位点siRNA模板序列插入质粒pRNAT-H1.1Neo中,PCR分析及基因测序进行鉴定;构建成功的重组质粒转染Hepal-6细胞48 h和72 h后,实时荧光定量PCR分析caspase-12 mRNA表达;Western印迹检测Caspase-12的表达.数据行t检验.结果 RT-PCR分析表明,第一对siRNA(siRNA*1)对caspase-12基因表达的抑制效率最高;重组质粒pRNAT H1.1Neo-caspase12(pRNAT-casp12)经PCR分析及测序表明,siRNA*1模板序列成功插入预计位点,且序列正确;pRNAT-casp12转染Hepal-6细胞48 h和72 h后,与空质粒对照组相比,caspase-12 mRNA水平分别下降72.5%和59.5%(P＜0.05);pRNAT-casp12转染后,caspase-12酶原表达量在24、48和72 h分别下调17.1%、37.3%和60.1%,48 h和72 h的抑制率比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 成功构建小鼠caspase-12特异性siRNA真核表达载体,它对小鼠肝癌细胞caspase-12基因的表达具有显著和特异的抑制作用.