Nestin特异性RNA干扰真核表达载体的构建及稳定株筛选

• 作者: 何峰 余伟华 夏添 杨旭辉 钟跃思 项鹏
• 来源期刊: 广东药学院学报
• 学科: 医学
• 关键词: RNAi nestin 黑色素瘤细胞
• 年，卷（期）: 2012,（2）
• 所属期刊栏目: 医学研究
• 页码范围: 204-207
• 分类号: Q786|R739.5
• 字数: 3363字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1006-8783.2012.02.026

摘要

目的 构建人nestin基因特异的RNA干扰质粒,为探讨抑制nestin基因表达对人黑色素瘤细胞生物学行为调控的研究奠定基础.方法 分别用30、50、80 nmol/L干扰或80 nmoL/L对照siRNA转染人黑色素瘤细胞株UACC903,48 h后用免疫荧光、RT-PCR和Western-blot鉴定nestin基因表达并筛选有效的序列,用有效或对照组序列的正义链和反义链,通过酶切、连接、转化和筛选,获得长期下调入nestin基因表达的慢病毒载体,并包装慢病毒感染人UACC903细胞,免疫组化和Western-blot鉴定干扰有效,以此获取nestin表达下调的UACC903细胞株.结果 重组质粒成功转化高感受态大肠杆菌,经Xho I和HPAI双酶切,琼脂糖凝胶电泳分析,结果表明寡核苷酸成功插入到预计位点,经测序鉴定,序列完全正确.干扰组或对照组慢病毒感染UACC903细胞后与对照组比较,干扰组mRNA和蛋白表达明显降低.结论 成功构建了针对人nestin基因的特异性shRNA真核表达载体,转染细胞后可抑制nestin基因的表达,为进一步研究其基因功能奠定了基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	钟跃思		29	212	9.0	13.0
2	项鹏	中山大学干细胞与组织工程中心	45	297	10.0	15.0
3	杨旭辉	广东省妇幼保健院生殖健康与不孕症科	12	94	6.0	9.0
5	余伟华	中山大学干细胞与组织工程中心	15	59	3.0	7.0
6	何峰	中山大学药学院	9	43	4.0	6.0