稳定表达sCD40L的CHO细胞系的建立和鉴定

• 作者: 于津浦 任秀宝 曹水 李慧 蒋华蔚
• 来源期刊: 中国肿瘤生物治疗杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 可溶性CD40配体 CHO细胞 绿色荧光蛋白 凋亡 Fas
• 年，卷（期）: 2007,（4）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 317-321
• 页数: 5页
• 分类号: R730.3
• 字数: 4255字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2007.04.004

摘要

目的: 建立稳定表达sCD40L的CHO细胞系.方法:从含sCD40L的载体pDC316-sCD40L中,将sCD40L编码序列克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP,获得重组质粒pIRES2-EGFP-sCD40L,酶切及测序鉴定.电穿孔转染CHO细胞,G418筛选抗性克隆,有限稀释法获取单克隆后扩大培养.流式细胞术、倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达;使用PCR、RT-PCR、ELISA方法分别从DNA、mRNA、蛋白水平对sCD40L的表达进行检测.Western blotting检测CHO-sCD40L分泌的sCD40L与膜型CD40的结合;将CHO-sCD40L与MDA-MB-231细胞共孵育24 h后,流式细胞术检测MDA-MB-231细胞表面分子Fas的表达变化;加入Fas激活性抗体(CH-11)后观察 MDA-MB-231细胞的凋亡.结果:成功构建质粒pIRES2-EGFP-sCD40L,转染CHO细胞后经克隆化培养获得稳定表达sCD40L的细胞系CHO-sCD40L.流式细胞术、倒置荧光显微镜检测绿色荧光蛋白表达高达90%以上;PCR检测证实sCD40L基因整合入细胞基因组DNA;RT-PCR检测到sCD40L mRNA的转录;ELISA法检测到细胞培养上清中有sCD40L蛋白表达,高达(4.5±2.1)ng/ml.Western blotting证实CHO-sCD40L分泌的sCD40L可与膜型CD40结合.CHO-sCD40L与MDA-MB-231细胞共培养后,MDA-MB-231细胞表面Fas表达由(3.0±1.02)%升高到(34.8±8.75)%;加入CH-11 24 h后,凋亡率由(5.4±1.32)%提高到(20.7±5.24)% (P＜0.01).结论:成功获得稳定表达sCD40L的CHO细胞系,为研究CD40/CD40L途径在肿瘤免疫治疗中的应用提供了有用的工具.