一个新的内切葡聚糖酶基因umcel5K的克隆、表达及其表达产物的酶学特性

• 作者: 冯家勋 刘利 唐纪良 段承杰 胡亚林 谭婉新
• 来源期刊: 广西农业生物科学
• 学科: 生物学
• 关键词: 未培养微生物 宏基因组文库 内切葡聚糖酶 克隆 表达
• 年，卷（期）: 2008,（1）
• 所属期刊栏目: 生物技术专栏
• 页码范围: 7-13
• 页数: 7页
• 分类号: Q78
• 字数: 5364字
• 语种: 中文

摘要

从水牛瘤胃内容物的添加滤纸为碳源的富集培养物中提取未培养微生物的总DNA,以柯斯质粒为载体构建了1个含约8000个克隆的宏基因组文库,对文库进行活性筛选获得1个既表达CMCase活性又表达4-MUCase酶活性的克隆.亚克隆及测序分析发现1个潜在的可编码333个氨基酸的ORF(OpenReading Frame),其蛋白质产物与1个来源于未培养细菌的糖苷水解酶家族5的纤维素酶CelA的同源性最高,两者的一致性为53%,相似性为68%.将PCR扩增的该基因完整的ORF克隆入表达载体pET30a(+),在大肠杆菌中得到其过量表达产物.经过Ni-NTA纯化后,该表达产物(Umcel5K)具有CMCase活性和4-MUCase酶活性,其最适pH是4.5～5.0,最适温度是50℃.pH耐受性检测表明.该酶在pH 4～4.5比较稳定.温度耐受性实验表明该酶不耐高温,在55℃以下比较稳定.经过镍柱纯化的酶液比活为26.15 U/mg.部分金属离子如Fe3+、Cr2+或Cu2+会抑制该酶的酶活,而另外一些金屑离子如K+、Li+等对Umcel5K的活性影响不大.