人釉原蛋白基因重组慢病毒载体的构建及在293T细胞中的表达

• 作者: 宋忠臣 张秀丽 束蓉 田聆 程岚 薛京伦 陈金中 黄璐
• 来源期刊: 上海口腔医学
• 学科: 医学
• 关键词: 釉原蛋白 重组慢病毒载体 转染 感染
• 年，卷（期）: 2008,（1）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 45-50
• 页数: 6页
• 分类号: R781.1
• 字数: 4535字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1006-7248.2008.01.011

摘要

目的:构建含人釉原蛋白(human Amelogenin,hAm)成熟肽编码区基因的慢病毒载体FuAmw,并观察在重组慢病毒感染的293T细胞中釉原蛋白的表达.方法:以构建好的重组质粒PQE30-Am为模板,采用PCR技术体外扩增hAm成熟肽编码区.将扩增产物与慢病毒载体转移质粒FUGW分别用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后连接,构建重组慢病毒载体,转移质粒FUAmW,并进行酶切及测序鉴定.通过聚乙烯亚胺(polytheylenimine,PEI)法将三质粒共转染293T细胞,包装得到重组慢病毒FUGW和FUAmW,然后分别离体感染293T细胞,培养 72h后,经荧光显微镜下观察和流式细胞计数检测感染效率,采用RT-RCR及Western印迹法检测釉原蛋白基因的表达.结果:重组质粒经测序证实.插入片段与人釉原蛋白成熟肽基因序列完全一致.流式细胞仪测得重组病毒感染293T细胞绿色荧光蛋白(green fluoresence protein,GFP)的阳性率为67.38%.RT-RCR和Western印迹均证实,重组慢病毒FUAmW感染的293T细胞能够表达人釉原蛋白.结论:成功构建携带人釉原蛋白成熟肽基因的重组慢病毒载体质粒,以293T细胞包装得到的重组人釉原蛋白病毒能感染真核细胞并获得表达.