PCR产物靶向克隆法构建pET15b-CAT及His-tag-CAT融合蛋白的表达与纯化

• 作者: 孔霞 王家宁 谭艳 郑飞 郭凌郧 黄永章
• 来源期刊: 郧阳医学院学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 过氧化氢酶 聚合酶链反应 靶向克隆 原核表达 组氨酸标签
• 年，卷（期）: 2008,（3）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 193-198,封2
• 页数: 7页
• 分类号: Q781|Q786
• 字数: 5382字
• 语种: 中文

摘要

目的:将人过氧化氢酶(Catalase,CAT) cDNA 的PCR扩增产物定向克隆到pET15b载体上以构建重组质粒pET15b-CAT,并表达和纯化出His-tag-CAT融合蛋白. 方法:扩增目的基因的PCR引物的5′端加上与线性化载体同源的碱基序列,以使PCR的扩增产物两端分别带上15个和线性化载体两端同源的碱基序列.以pZeoSV2(+)-CAT为模板进行靶向克隆所需的人CAT cDNA扩增. 将纯化的人CAT cDNA PCR产物与经XhoⅠ和BamHⅠ酶切的线性化载体pET15b以6∶1摩尔数之比混合于含重组酶的反应液中,25 ℃反应30 min,将PCR产物定向克隆于目标载体pET15b上,获得重组质粒pET15b-CAT.重组质粒经PCR,XhoⅠ酶切和DNA测序鉴定.pET15b-CAT转化BL21(DE3)宿主菌,用IPTG诱导表达出His-tag-CAT融合蛋白,采用Ni2+-NTA树脂进行亲和层析. 结果:人CAT cDNA的PCR扩增产物与经XhoⅠ和BamHⅠ酶切的线性化载体pET15b发生了同源重组反应,经鉴定采用PCR产物靶向克隆法成功构建了pET15b-CAT.SDS-PAGE和Western blot结果表明,转化了pET15b-CAT的宿主菌表达出了His-tag-CAT融和蛋白,经Ni2+-NTA树脂亲和层析得到了纯化的His-tag-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶的活性,活性值为80.23 U/g.结论:采用PCR产物靶向克隆法成功地构建了pET15b-CAT,并表达和纯化出了His-tag-CAT融和蛋白,为采用外源性CAT防治与氧化应激损伤相关性疾病奠定了基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	孔霞	郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所	19	181	8.0	13.0
2	郭凌郧	郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所	26	189	9.0	12.0
3	王家宁	郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所	119	709	13.0	20.0
4	黄永章	郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所	66	379	11.0	16.0
5	郑飞	郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所	9	73	5.0	8.0
6	谭艳	郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所	9	62	5.0	7.0