绿色荧光蛋白标记重组人偏肺病毒的制备

• 作者: 步志高 葛金英 赵晓东 陈昕
• 来源期刊: 中华微生物学和免疫学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 反向遗传技术 人偏肺病毒 病毒拯救 细胞病变效应 绿色荧光蛋白
• 年，卷（期）: 2009,（5）
• 所属期刊栏目: 病毒学
• 页码范围: 443-448
• 页数: 6页
• 分类号: R3
• 字数: 4223字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.0254-5101.2009.05.015

摘要

目的 人偏肺病毒(human metapneumovirus,hMPV)可致人上、下呼吸道感染.研究利用反向遗传学技术,以带绿色荧光蛋白(GFP)标记的hMPV NL/1/00全长cDNA质粒及4种辅助质粒pCITE-N、pCITE-P、pCITE-M2.1和pClTE-L为基础,在体外制备GFP标记的重组hMPV病毒(命名为rhMPV NL/1/00 GFP).方法 采用LipofectAMINE 2000将带GFP标记的hMPV NL/1/00全长cDNA质粒以及蛋白表达质粒pcITE-N、pCITE-P、pCITE-M2.1和pcITE-L共转染BSR-T7细胞,3 d后取BSR-T7细胞上清液感染Vero-E6细胞,1-4 d后观察Veto-E6细胞出现明显细胞病变(CPE)和绿色荧光,持续观察至第10天.收集病毒上清用于病毒滴度检测.提取培养上清的病毒RNA并通过RT-PCR方法扩增病毒N基因、F基因和G基因验证所获重组病毒.结果 Vero-E6细胞接种1～4 d后观察到明显CPE和绿色荧光,随后CPE加重,荧光信号加强,持续至感染后10 d;第1、5、10、15和20代病毒的滴度波动于105.0～106.5TCID50/ml;RT-PCR检测出符合预期大小的910 bp(N)、450 bp(F)和980 bp(G)条带,经卜述片段cDNA序列测定和比对表明获得的重组病毒与hMPV NL/1/00原型病毒序列一致.rhMPV NL/1/00 GFP重组病毒在体外传代20代后,遗传信号和荧光信号均稳定.结论 采用反向遗传学技术成功拯救了具有感染性的重组hMPV病毒,为hMPV感染发病机制及疫苗研究奠定了基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	步志高	中国农业科学院哈尔滨兽医研究所人兽共患病实验室	31	398	10.0	19.0
2	陈昕	重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所生物安全二级实验室	7	75	4.0	7.0
3	葛金英	中国农业科学院哈尔滨兽医研究所人兽共患病实验室	12	68	6.0	8.0
4	赵晓东	重庆医科大学附属儿童医院肾脏免疫科	139	1045	19.0	27.0