表达绿色荧光蛋白重组鸭肠炎病毒构建

• 作者: 孙莹 曹明慧 李俊平 李启红 李岭 李慧姣 杨承槐 黄小洁
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 鸭肠炎病毒 UL2基因 绿色荧光蛋白 重组病毒
• 年，卷（期）: 2016,（14）
• 所属期刊栏目: 专题:水禽传染病
• 页码范围: 2805-2812
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.014

摘要

[目的]鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)不同毒株间存在明显差异,DEV疫苗株的UL2基因在195bp后连续缺失528bp,导致第65位氨基酸后连续缺失176aa[1].将绿色荧光蛋白(GFP)基因插入DEV UL2基因中,获得表达绿色荧光蛋白的重组病毒,以研究UL2基因对DEV生物特性的影响和探讨DEV作为载体表达外源基因的可行性.[方法]以实验室保存的DEV细胞适应株DNA为模板,利用PCR技术扩增出病毒UL2基因上下游序列并克隆入pMD-18T载体;以UL2基因作为外源基因插入靶点及同源重组臂,将CMV启动子控制的含有GFP-gpt基因表达盒克隆入DEV UL2基因中,构建含GFP基因的转移质粒载体pT-UL2-GFP-gpt;用脂质体将其与DEV细胞适应株共转染CEF细胞,待80％细胞出现病变后,冻融3次,接种到新鲜CEF细胞单层的6孔培养板中,用含5％血清、1％6双抗、1％琼脂的M199培养液覆盖,在荧光显微镜下挑取单个有绿色荧光的蚀斑,再接到新的细胞上,重复蚀斑筛选、纯化表达绿色荧光蛋白的重组病毒;利用PCR、基因测序技术鉴定重组病毒;重组病毒接种CEF (moi=0.01),每12h取出1瓶接毒细胞,分别收集上清和细胞,测量其病毒含量,绘制一步生长曲线;重组病毒在CEF中连续传代20次,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,并用PCR检测GFP的传代稳定性;重组病毒免疫4周龄SPF鸭后14d,肌肉注射接种DEV强毒(CVCC AV1221),观察免疫保护情况.[结果]经双酶切鉴定,成功构建了含绿色荧光蛋白报告基因的转移质粒载体pT-UL2-GFP-gpt,将其与DEV共转染CEF细胞后8h,即可见转染细胞中有带有绿色荧光的梭形细胞,经过8轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△UL2-GFP-gpt;PCR鉴定及基因测序结果显示,GFP标记基因成功地插入到DEV基因组中,替换了DEV UL2基因的196-723位核苷酸;一步生长曲线结果显示,重组病毒在细胞和上清中的病毒含量分别在36h和72h达到峰值,为106.2TCID50/0.1mL、1055TCID50/0.1mL,与亲本毒无明显差异;重组病毒在CEF中连续传代,1-5代可以稳定表达GFP基因,第6代起,开始出现少量没有荧光的细胞病变,15-20代中绝大部分细胞病变无绿色荧光,GFP在细胞连续传代过程中容易出现突变;重组病毒以103.0TCID50/只免疫麻鸭,免疫后14d能完全抵抗DEV强毒株的攻击,与亲本毒免疫原性一致.[结论]成功构建了表达绿色荧光蛋白的DEV,首次证实UL2基因缺失不影响其在细胞中的复制,也不影响其免疫原性.荧光重组病毒的构建为DEV UL2基因功能、活载体疫苗研究奠定了基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	李俊平		46	230	8.0	14.0
2	李慧姣		57	131	5.0	9.0
3	杨承槐		43	128	6.0	9.0
4	李启红		41	106	5.0	8.0
5	曹明慧		11	21	3.0	4.0
6	黄小洁		16	73	4.0	8.0
7	李岭		13	11	2.0	3.0
8	孙莹		2	7	2.0	2.0