EspA-Stx2A<em>1</em>融合蛋白的表达、纯化及其免疫学活性

• 作者: 张卫军 毛旭虎 程琰 罗萍 邹全明 顾江
• 来源期刊: 解放军检验医学杂志
• 关键词: 肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7 EspA Stx2A1 融合蛋白 免疫活性
• 年，卷（期）: 2010,（1）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 35-41,54
• 页数: 8页
• 语种: 中文

摘要

目的 在原核表达系统巾表达并纯化肠出血性大肠杆菌O157:H7(EHEC O157:H7)Ⅲ型分泌蛋EspA与Stx2毒素的A1亚单位(Stx2A1)的融合蛋白.方法 PCR方法扩增espA、stx2A1全长基因,利用重叠延伸PCR技术获得espA-stx2A1融合基因,T-A克隆后插入表达载体Pet-28a(+),构建原核表达载体Pet-28a(+)-espA-stx2A1,转化大肠杆菌BL21(DE3),分别在37℃和25℃用IPTG诱导融合蛋白表达,SDS-PAGE检测其表达量及表达形式.以EspA单克隆抗体亲和层析柱纯化目的蛋白,通过免疫动物实验,Western blotting鉴定其免疫原性和反应原性.将融合蛋白EspA-stx2A1皮下注射免疫BALB/c小鼠,再以天然Stx2毒素腹腔注射免疫后的小鼠,观察攻毒保护效果;通过细胞毒实验检测融合蛋白免疫小鼠后获得的抗血清在体外是否具有中和毒素的作用.结果 重叠延伸PCR方法扩增出了1319bp(espA-stx2A1)的融合基因片段并构建了重组表达载体,重组质粒中目的基因序列与理论值一致性为100%;目的蛋白在25℃时的表达量明显高于37℃时的表达量,两种温度条件下目的蛋白均主要以包涵体形式呈现;25℃时的诱导表达量约占菌体总蛋白的40%,以亲和层析一步纯化可获得纯度为90%的重组蛋白;Western blotting结果证实融合蛋白与EspA单克隆抗体和Stx2A1单克隆抗体均发生特异免疫反应,以目的蛋白免疫Balb/c小鼠制备的抗血清能分别与O157:H7的EspA、Stx2A发生特异性免疫反应.融合蛋白免疫小鼠能够抵御致死剂量天然Stx2毒素攻击,致死保护率达到95%.免疫BALB/c小鼠后血清特异性抗体可以中和天然Stx2毒素,使Hela细胞保持正常形态.结论 成功表达了EspA-Stx2A1融合蛋白,纯化的融合蛋白EspA-Stx2A1显示了较好的免疫保护效果,为研制EHEC O157:H7基因工程多亚单位疫苗奠定了基础.