shRNA/mrp1表达载体构建及其体外表达研究

• 作者: 严律南 刘强 杨建青 潘光栋 肖亿 褚光平
• 来源期刊: 中华肝胆外科杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 基因表达 多药耐药 构建
• 年，卷（期）: 2010,（1）
• 所属期刊栏目: 实验研究
• 页码范围: 48-53
• 页数: 6页
• 分类号: R3
• 字数: 5328字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.1007-8118.2010.01.016

摘要

目的 构建shRNA/mrp1的质粒表达载体并验证其体外表达效率.方法 根据业已筛选出的mrp1基因RNAi靶序列,按照pSUPER的设计要求合成64 bp的寡核苷酸序列,将其退火后形成双链并用双酶切法克隆到pSUPER得到质粒pSUPER-shRNA/mrp1,转染感受态大肠杆菌,筛选阳性克隆,经测序证实后扩增培养并以去内毒素试剂盒提取,然后转染HepG2/mrp1细胞,阴性载体为对照组,Real-time PCR、流式细胞术检测mrp1基因mRNA、MRP1表达、细胞耐药性等功能变化.结果 成功构建质粒载体pSUPER-shRNA/mrp1,经基因测序证实靶序列插入正确;HepG_2/mrp1组Ct值较GAPDH增加5.61,HepG_2/mrp1-si组Ct值比GAPDH升高11.35,mrp1基因的表达水平是耐药株HepG_2/mrp1的179分之一;实验组HepG_2/mrp1细胞和阴性对照组HepG_2/mrp1细胞的MRP表达率分别为11.2%和97.6%,差别有统计学意义(P<0.05);药物敏感试验显示HepG_2/mrp1细胞耐药倍数从45.0下降到1.2,相对逆转效率99.62%;细胞内DNR累积量也明显增加,与对照组比较(78.58%vs 38.44%,P<0.05).结论 成功构建质粒载体pSUPER-shRNA/mrp1,在HepG2/mrp1内稳定表达,逆转其耐药性.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	潘光栋		17	68	4.0	7.0
2	杨建青		17	32	3.0	5.0
3	褚光平		21	101	6.0	9.0
4	刘强		48	172	7.0	11.0
5	肖亿		25	83	4.0	8.0
6	严律南		326	1652	17.0	25.0