rAAV2-hGAD65重组载体的构建和功能检测

• 作者: 徐群渊 段德义 赵君朋 赵春礼 赵焕英 郑德宇
• 来源期刊: 解剖学报
• 学科: 医学
• 关键词: 谷氨酸脱羧酶2 腺相关病毒载体 基因克隆 反转录-聚合酶链式反应 人
• 年，卷（期）: 2010,（1）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 18-21
• 页数: 4页
• 分类号: R322|Q189
• 字数: 3105字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.0529-1356.2010.01.004

摘要

目的 构建rAAV2-hGAD65重组载体,观察其体内外功能.方法 应用RT-PCR的方法克隆hGAD65基因,与AAV载体连接得到重组载体(rAAV2-hGAD65).包装重组腺相关病毒并检测病毒的滴度.体外感染成纤维细胞后,用免疫组织化学的方法检测GAD65在细胞中的表达水平,用高效液相色谱(HPLC)法检测培养上清中γ-氨基丁酸(GABA)的含量.在体实验中,向丘脑底核(STN)立体定位注射rAAV2-hGAD65后,用HPLC方法检测黑质网状部(SNr)中的GABA含量.结果 应用RT-PCR方法成功地从人胚胎端脑组织中克隆出GAD65基因的cDNA,基因测序显示与基因库中人GAD65基因序列一致,亚克隆入AAV载体并包装后所得的病毒颗粒的滴度达到4.5×10~(11)/ml.组织化学检测感染大鼠肺成纤维细胞的效率约为80%,HPLC检测培养上清中GABA的含量为(45.66±6.07)nmol/L.STN立体注射rAAV2-hGAD65后,在STN可以检测到hGAD65的表达,SNr区GABA的含量由原来的(5.66±1.07)nmol/g升高到(12.66±2.59)nmol/g.结论 成功地克隆出了人GAD65基因,并构建了AAV重组载体.AAV病毒颗粒在体外能感染成纤维细胞并具有催化谷氨酸合成GABA的功能.在体内实验中,向STN注射rAAV2-hGAD65后,可以增加黑质网状部(SNr)中的GABA含量.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	徐群渊	首都医科大学神经科学研究所	140	593	11.0	17.0
2	赵焕英	首都医科大学神经科学研究所	55	178	7.0	11.0
3	段德义	首都医科大学神经科学研究所	29	70	4.0	6.0
4	赵春礼	首都医科大学神经科学研究所	45	182	8.0	11.0
5	郑德宇	辽宁医学院解剖学教研室	41	120	6.0	8.0
7	赵君朋	首都医科大学神经科学研究所	20	21	3.0	3.0