pNTAP-PRAK真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

• 作者: 刘爱华 姜勇 明小燕 梅柱中 王丹 王旭 王达安 邓鹏 魏洁 龚小卫
• 来源期刊: 中国病理生理杂志
• 学科: 生物学
• 关键词: p38调节活化蛋白激酶 克隆,分子 基因表达
• 年，卷（期）: 2010,（9）
• 页码范围: 1813-1817
• 分类号: Q78
• 字数: 4183字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1000-4718.2010.09.030

摘要

目的: 构建pNTAP-PRAK真核表达质粒,并建立其稳定表达的HEK293细胞系.方法: 将人的PRAK亚克隆至串联亲和纯化(tandem affinity purification, TAP)载体pNTAP质粒上,构建成重组质粒pNTAP-PRAK,转化该重组质粒至感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆进行PCR、酶切及DNA测序验证正确后,利用PolyFect脂质体介导将其转染至HEK293细胞中,再通过G418筛选建立稳定表达TAP tag-PRAK融合蛋白的HEK293细胞系;利用Western blotting和细胞免疫荧光标记法检测融合蛋白TAP tag-PRAK的表达及细胞内定位情况.结果: 重组真核表达载体构建正确,该重组质粒能在HEK293细胞中稳定表达,表达产物TAP tag-PRAK主要分布在核内.结论: 成功构建pNTAP-PRAK真核表达载体并建立了其稳定表达的HEK293细胞系,TAP标签未对PRAK定位产生明显影响.