人睾丸基因TDRG1重组真核载体的构建及其表达

• 作者: 戴英波 文甲明 汤育新 肖小旺 蒋先镇 阳建福 陈厚仰
• 来源期刊: 中国男科学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: TDRG1基因 克隆 真核载体 基因转染
• 年，卷（期）: 2010,（8）
• 页码范围: 6-9
• 分类号: R392-33
• 字数: 2542字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1008-0848.2010.08.002

摘要

目的 构建人睾丸基因TDRGl的真核表达质粒,并研究其表达.方法 取人新鲜正常睾丸组织,提取总RNA,采用逆转录.聚合酶联链反应(RT-PCR)扩增TDRG1基因编码序列;将该基因克隆到真核表达载体pYD5中,构建真核细胞表达载体pYD5-TDRG1,用限制性内切酶酶切分析,DNA序列分析鉴定重组质粒;将测序正确的重组质粒pYD5-TDRG1在脂质体介导下转染293细胞,间接免疫荧光法和Western Blot法鉴定目的 蛋白质的表达.结果 RT-PCR扩增出TDRGl基因编码序列,目的 插入片段长约303bp:产物行限制性内切酶酶切后连接到真核表达载体pYD5,重组质粒pYD5-TDRG1经酶切及DNA测序鉴定构建成功:该质粒转染293细胞48h后在荧光显微镜下可观察到绿色荧光,阳性细胞率96.42%;行Western blot分析检测到约39-8kD的目的 蛋白表达.结论 成功构建了人类睾丸基因TDRG1的真核表达载体pYD5-TDRG1,TDRG1基因在293细胞内成功表达.