重组大鼠谷氨酸脱羧酶载体的构建和功能分析

• 作者: 刘建生 姚素艳 孔令菊 张继波 徐群渊 王倩 郑德宇
• 来源期刊: 神经科学通报（英文版）
• 关键词: 大鼠谷氨酸脱羧酶2 慢病毒载体 基因克隆 帕金森病
• 年，卷（期）: 2011,（6）
• 页码范围: 430-435
• 页数: 6页
• 语种: 英文

摘要

目的 谷氨酸脱羧酶2(glutamic acid decarboxylase 2,GAD65)是γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)的合成酶.本研究拟构建重组大鼠GAD65基因的慢病毒载体(recombinant lentivirus-rGAD65,rLV-rGAD65),并在体内外分析其功能.方法 用RT-PCR法克隆大鼠GAD65基因的cDNA并亚克隆至慢病毒载体上,形成重组慢病毒质粒(rLV-GFP-rGAD65).在包装质粒的帮助下,获得重组慢病毒颗粒(rLV-rGAD65)并检测其滴度.用rLV-rGAD65感染原代培养的大鼠肺成纤维细胞,并用免疫细胞化学和蛋白印迹法检测rGAD65在成纤维细胞中的表达,用高效液相法(high-performance liquid chromatograph,HPLC)检测培养上清中GABA的含量.在体内,rLV-rGAD65定点注射到Sprague-Dawley大鼠的丘脑底核(subthalamic nucleus,STN).用免疫组织化学和蛋白印迹法检测GAD65基因在STN中的表达水平,HPLC检测黑质网状部(substantia nigra pars reticulata,SNr)中GABA的含量.结果 rGAD65的序列与GenBank几乎一致,没有碱基的突变.rLV-rGAD65的滴度达6.8×108/mL.在体外,rLV-rGAD65对成纤维细胞的感染效率可达80％,而对照组中几乎没有GAD65蛋白的表达.在上清液中,osce,rGAD65与绿色荧光蛋白共表达于注射侧的STN区,GAD65蛋白的含量明显高于对照组和注射的对侧.GABA在SNr中的含量也从(5.95±1.09)升高到(12.44±3.79)nmol/g.结论 重组GAD65载体构建成功.在体外,重组慢病毒颗粒可以感染原代培养的成纤维细胞,并能催化GABA的合成.在体内,重组慢病毒颗粒可以感染STN的神经元并能使SNr中GABA的含量增加.