重叠延伸PCR克隆三孢布拉霉carRA基因及其功能活性检测系统的构建

• 作者: 于淼 刘静 刘龙 张利平 汤晖 牛宏彦 石楠 贾颖
• 来源期刊: 生物工程学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 重叠延伸PCR carRA基因 番茄红素环化酶 八氢番茄红素合成酶
• 年，卷（期）: 2011,（7）
• 所属期刊栏目: 基因工程
• 页码范围: 990-997
• 分类号: Q949.326.1
• 语种: 中文

摘要

三孢布拉氏霉菌CarRA蛋白,既有番茄红素环化酶功能活性又有八氢番茄红素合成酶功能活性,为了对CarRA蛋白进行双功能活性分析,及探测CarRA蛋白的番茄红素环化酶功能活性位点,构建了在大肠杆菌体内通过颜色互补检测两种酶活性的系统.通过重叠延伸PCR的方法克隆得到了carRA基因,并构建原核表达载体pET28a-carRA,与携带crtI/crtB/crtE基因簇的质粒pAC-LYC共转化BL21(DE3),验证番茄红素环化酶功能活性；与以pAC-LYC为基础构建的携带crtI/crtE基因簇的质粒pAC-LYC△(crtB)共转化BL21(DE3),验证八氢番茄红素合成酶功能活性.通过颜色互补的初步鉴定,再以HPLC对代谢产物进行分析,明确了实验中的CarRA蛋白功能活性检测系统的可靠性,为定点突变番茄红素环化酶活性位点而不影响八氢番茄红素合成酶功能活性提供了筛选模型.