鸡源细胞基因沉默及快速筛选的实用型双标记RNAi载体

• 作者: 张改平 李培培 游雷鸣 王爱萍 罗俊 蒋志政 郅玉宝 鄂魏
• 来源期刊: 中国生物工程杂志
• 学科: 生物学
• 关键词: EGFP H1启动子 RNAi载体 双标记筛选
• 年，卷（期）: 2011,（11）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 81-89
• 分类号: Q782
• 语种: 中文

摘要

利用人H1 RNA启动子、EGFP基因及Neomycin抗性基因,构建用于禽类细胞基因持续沉默和快速筛选的实用型RNAi载体.在将pCDNA3.1(+)载体上的SV40启动子替换为鸡源的β-actin 启动子后,装入EGFP基因表达框以及用于驱动外源shRNA转录的人H1 RNA启动子,构建成同时具有EGFP和Neomycin抗性双标记的RNAi载体,并为载体引入独特设计的含媒介序列的多克隆位点以方便外源shRNA编码小片断插入后的快速筛选,载体设计非常实用.插入靶向EGFP和sIgMλ基因的shRNA编码序列后分别瞬时转染DF-1和DT40细胞,结果显示靶基因表达得到了明显抑制.联用EGFP和Neomycin双标记快速筛选sIgMλ轻链基因稳定沉默的DT40细胞克隆的结果也证实,H1启动子转录shRNA的干扰效果是高效的,双标记筛选策略不仅有效而且方便、快捷.