重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP及其突变体的构建与鉴定

• 作者: 冯文莉 史静 彭智 曹唯希 李亚娟 王海霞 罗红伟 陶崑
• 来源期刊: 中国生物制品学杂志
• 学科: 生物学
• 关键词: 重组腺病毒 含SH2域蛋白质酪氨酸磷酸酶类 K562细胞 细胞增殖
• 年，卷（期）: 2011,（5）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 507-512
• 分类号: Q782
• 语种: 中文

摘要

目的 构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和HA标签的SH2基因重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP及其突变体Ad5-hSH2mt-EGFP,并观察其对K562细胞增殖的影响.方法 设计并化学合成引物,采用RT-PCR法扩增hSH2基因,重叠PCR法扩增hSH2mt基因,分别克隆至pAdTrack-CMV,构建穿梭质粒,经Pme I酶切,转化感受态pAdEasy-BJ5183,在细菌内同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒质粒pAd5-hSH2-EGPF和pAd5-hSH2mt-EGPF.Pac Ⅰ酶切后转染AD293细胞进行包装,获得重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP和Ad5-hSH2mt-EGFP,扩增病毒,测定滴度并经PCR和Western blot鉴定.重组腺病毒感染K562细胞,MTT法检测病毒对K562细胞增殖活性的影响.结果 重组腺病毒质粒pAd5-hSH2-EGFP和pAd5-hSH2mt-EGFP经酶切鉴定构建正确;重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP和Ad5-hSH2mt-EGFP的滴度均可达1.6×1012;PCR结果表明,2种重组腺病毒包装和扩增成功,Western blot结果表明,重组腺病毒携带的目的 基因能够在AD293细胞中表达;MTT检测证实,Ad5-hSH2-EGFP 对K562细胞的增殖具有明显的抑制作用.结论 已成功构建重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP和Ad5-hSH2mt-EGFP,Ad5-hSH2-EGFP能在体外明显抑制K562细胞的增殖,为进一步探讨SH2基因对慢性粒细胞白血病的治疗作用及其机制奠定了基础.