小鼠Pim-3基因siRNA慢病毒载体的构建及表达

• 作者: 张鹏 杨汉东 郎明健 钱航 闵新文 陈继舜
• 来源期刊: 湖北医药学院学报
• 学科: 生物学
• 关键词: Pim-3 RNA干扰 慢病毒载体
• 年，卷（期）: 2012,（3）
• 所属期刊栏目: 分子生物学
• 页码范围: 186-190,196,封2
• 分类号: Q782
• 字数: 5241字
• 语种: 中文

摘要

目的:本研究拟构建针对Pim-3基因的siRNA慢病毒载体,诱导靶细胞中Pim-3基因沉默.方法:分析Pim-3 mRNA序列特征,根据siRNA设计原则,设计并合成特异性针对小鼠Pim-3的siRNA靶DNA序列及阴性对照序列.用限制性核酸内切酶将pGCSIL-GFP载体线性化,将寡DNA片段退火成含有粘性末端的DNA双链后,与慢病毒骨架质粒连接转化至大肠杆菌中进行重组,运用PCR技术筛选阳性克隆并测序,得到pSC-Pim-3 shRNA质粒.采用脂质体将pSC-Pim-3 shRNA质粒和辅助包装质粒共转染到HEK293细胞中包装形成慢病毒.采用倍比稀释法测定慢病毒滴度.慢病毒感染NIH3T3细胞,运用实时定量PCR技术检测Pim-3基因mRNA表达水平,运用蛋白免疫印迹技术检测Pim-3蛋白表达水平.结果:酶切后获得7.5 kb的pGCSIL-GFP片段.DNA片段成功连接到pGCSIL-GFP载体；重组慢病毒的滴度约为2×109 TU/mL.慢病毒能够高效感染靶细胞,并显著抑制内源性Pim-3基因的mRNA(抑制率超过70％)和蛋白(抑制率超过80％)表达.结论:针对Pim-3基因靶序列CCTCTTCGACTTCATCACT的shRNA重组慢病毒能够有效沉默靶细胞Pim-3基因.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	闵新文	湖北医药学院心脏病中心	31	175	6.0	12.0
2	张鹏	湖北医药学院心脏病中心	34	230	9.0	14.0
6	郎明健	湖北医药学院心脏病中心	15	56	5.0	7.0
7	钱航	湖北医药学院心脏病中心	11	20	3.0	4.0
8	杨汉东	湖北医药学院心脏病中心	13	57	4.0	7.0
9	陈继舜	湖北医药学院心脏病中心	5	14	3.0	3.0