SPARC基因RNAi慢病毒载体的构建及其在SKM-1细胞中的表达

• 作者: 刘林 叶兴伟 周洪静 杨泽松 王利 罗静 肖青 蒋文
• 来源期刊: 细胞与分子免疫学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: SPARC RNA干扰 慢病毒 SKM-1
• 年，卷（期）: 2012,（5）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 466-469
• 分类号: R511.3
• 语种: 中文

摘要

目的:构建SPARC基因RNAi慢病毒载体获得稳定产毒的细胞,并观察其对人MDS细胞株SKM-1细胞的转染效率及其对SPARC基因的抑制效率.方法:针对已经筛选确定的SPARC基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生GC-shSPARC慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定.用GC-shSPARC、pHelper1.0和pHelper 2.0载体共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度,并将获得的重组慢病毒CC-shSPARC转染SKM-1细胞,通过荧光显微镜检测转染后GFP表达情况,测定转染效率；RT-PCR和Western blot分别验证转染后SKM-1细胞SPARC mRNA及蛋白的表达.结果:经测序证实,构建出了SPARC shRNA的慢病毒载体GC-sh SPARC.包装、浓缩病毒悬液的滴度为1×109 TU/mL.荧光显微镜下能直接观察到转染组细胞的GFP表达,转染效率为70％,RT-PCR、Western blot技术分别检测到GC-shSPARC慢病毒转染SKM-1细胞SPARC mRNA、SPARC蛋白表达水平较空白组明显降低(P＜0.05).结论:成功构建SPARC基因RNAi慢病毒载体,其能高效干扰SKM-1细胞SPARC基因的表达.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	刘林	重庆医科大学附属第一医院血液科	96	300	8.0	14.0
2	杨泽松	重庆医科大学附属第一医院血液科	60	239	8.0	11.0
3	肖青	重庆医科大学附属第一医院血液科	62	161	6.0	10.0
4	罗静	重庆医科大学附属第一医院血液科	17	36	3.0	5.0
5	叶兴伟	重庆医科大学附属第一医院第一分院超声科	4	9	2.0	3.0
6	蒋文	重庆医科大学附属第一医院血液科	4	4	2.0	2.0
7	周洪静	重庆医科大学附属第一医院血液科	3	4	2.0	2.0