DEK基因RNAi慢病毒表达载体的构建及其功能鉴定

• 作者: 丁丽华 刘婕 叶棋浓 吕朝晖 张亚楠 朱杰 禾荣华 罗晓丽 陈志达
• 来源期刊: 军事医学
• 学科: 医学
• 关键词: DEK基因 RNA干扰 慢病毒载体 乳腺肿瘤 人乳腺癌细胞ZR75-1 基因表达 质粒 转染
• 年，卷（期）: 2015,（7）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 499-503
• 页数: 5页
• 分类号: R737.9
• 字数: 4102字
• 语种: 中文
• DOI: 10.7644/j.issn.1674-9960.2015.07.003

摘要

目的：构建DEK基因的RNA干扰（ RNAi）慢病毒表达载体，并对其生物学功能进行初步检测。方法采用RNAi技术，根据DEK基因的序列，确定其有效靶序列，合成DEK基因的Oligo DNA，退火形成双链DNA，将其克隆到经BamHⅠ与EcoRⅠ酶切后的小干扰RNA（ siRNA）表达载体PSIH-H1上，产生PSIH-H1-DEK慢病毒载体，筛选阳性克隆并测序鉴定。与3个包装质粒共转染293T细胞，包装成慢病毒后感染乳腺癌细胞ZR75-1，经嘌呤霉素（ puromycin，puro）筛选2周后，收集部分细胞利用实时聚合酶链反应（ real time-PCR，RT-PCR）和Western印迹分别检验DEK在信使RNA （ mRNA ）和蛋白水平的敲低效果，并通过细胞生长实验检测DEK对人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞生长的影响。结果 PCR和DNA测序结果证实，DEK siRNA慢病毒表达载体PSIH-H1-DEK构建成功。 RT-PCR和Western印迹结果显示，构建的DEK siRNA可有效抑制DEK基因的表达，并由此建立了敲低DEK的稳定克隆。生长曲线实验表明， DEK siRNA可抑制人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞的生长。结论成功构建了DEK基因的RNAi慢病毒表达载体，感染人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞后，有效沉默了ZR75-1细胞中的DEK基因的表达，为进一步研究DEK基因在乳腺癌中的作用奠定基础。