小鼠RelB基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

• 作者: 刘杰 包杰 曾方银 李娟 熊石龙 王前 裘宇容 郑磊
• 来源期刊: 解放军医学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 基因,RelB RNA干扰 慢病毒载体 滴度
• 年，卷（期）: 2007,（6）
• 所属期刊栏目: 实验研究
• 页码范围: 585-587
• 页数: 3页
• 分类号: R34
• 字数: 2565字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:0577-7402.2007.06.012

摘要

目的 构建小鼠RelB基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默骨髓树突细胞(DC)的RelB基因表达,为构建骨髓致耐受DC用于自身免疫病的防治提供研究基础.方法 利用Invitrogen公司在线软件设计小鼠RelB基因(NM_009046)shRNA序列,合成、退火形成dsoligo后克隆到pENTRTM/U6载体的黏性末端,测序,得到的阳性重组子再与慢病毒载体进行重组,转化stbl3感受态细胞,测序鉴定,在脂质体的介导下将慢病毒的包装混合物和RelB基因重组慢病毒载体导入293FT细胞,包装成病毒后,收集病毒上清,采用系列稀释法测定病毒滴度.结果 测序结果显示pENTRTM/U6-RelB-shRNA为阳性克隆,将该阳性重组载体与慢病毒载体重组,转化,氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,U6前引物测序鉴定,测序结果 显示该重组慢病毒载体也为阳性克隆,在293FT细胞中进行病毒包装,收集上清并在-80℃贮存.系列稀释法检测病毒悬液的滴度为6×105TU/ml.结论 成功构建出小鼠RelB基因shRNA慢病毒RNAi表达载体,为制备致耐受DC和研究DC在自身免疫病中的应用提供了稳定的转染细胞载体.