大鼠siTLR4重组腺病毒载体的构建及功能鉴定

• 作者: 张赟 李廷玉 毕杨 江伟 陈洁 魏小平 龚敏
• 来源期刊: 免疫学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: TLR4 siRNA 重组腺病毒载体 NF- κB 免疫调节
• 年，卷（期）: 2012,（9）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 792-796
• 页数: 5页
• 分类号: R34
• 语种: 中文

摘要

目的 构建特异性针对大鼠TLR4基因的siRNA重组腺病毒载体,为进一步研究TLR4在不同疾病中的免疫调节机制奠定重要基础.方法 设计并合成3对大鼠TLR4基因的siRNA序列,退火处理后定向克隆到pSES-HUS穿梭质粒中,获得pSES-HUS siTLR4,经Pme Ⅰ线性化后与pAdEasy-1骨架质粒在BJ5183细菌中进行同源重组,从而构建pAd-siTLR4质粒,通过脂质体转染,在HEK293细胞中包装形成Ad-siTLR4腺病毒颗粒,用该病毒感染PC12细胞,从基因和蛋白质水平分别检测3对siTLR4的抑制效果,同时从蛋白质水平检测TLR4 下游关键分子NF-κB的表达.结果 PCR、酶切和测序均证实目的基因正确克隆到所构建的pAd siTLR4重组腺病毒载体中;经包装获得的Ad -siTLR4病毒颗粒在PC12细胞中能够有效地抑制TLR4 mRNA和蛋白水平的表达,并显著地降低了NF- κB的表达.结论 成功构建了pAd-siTLR4重组腺病毒质粒,同时包装获得了 Ad -siTLR4重组腺病毒,转染PC12细胞后不仅能明显降低TLR4的表达,而且有效地抑制了TLR4通路下游关键分子NF-κB的表达.