应用Gateway技术构建pLenti6-Akt shRNA真核表达载体

• 作者: 何敏 庄俊华 李曼 赵学芹 黄宪章
• 来源期刊: 国际检验医学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: Akt基因 短发卡RNA Gateway HepG2细胞 遗传载体
• 年，卷（期）: 2012,（15）
• 所属期刊栏目: 基础实验研究论著
• 页码范围: 1798-1800
• 分类号: R735.7
• 字数: 3507字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1673-4130.2012.15.003

摘要

目的 应用Gateway技术构建靶向人Akt基因的shRNA真核表达载体,转染肝癌细胞株HepG2,验证该载体能否下调Akt基因的mRNA水平.方法 以Akt基因为靶点设计两条具有短发卡结构的shRNA序列,经退火成互补双链后克隆入pENTR/U6入门表达载体(pENTR/U6-Akt1,pENTR/U6-Akt2);转化E.coli TOP10菌株,挑取阳性菌落进行菌落PCR和测序鉴定;利用Gateway技术进行LR位点特异性重组,将shRNA导入目的 表达载体pLenti6/Block-it DEST Vector,再行测序鉴定(pLenti6-Akt1,pLenti6-Akt2);将重组质粒转染肝癌细胞株HepG2,提取RNA,RT-PCR检测重组质粒对mRNA水平的抑制效果.结果 经菌落PCR和DNA测序鉴定:pENTR/U6-Akts入门载体和pLenti6-Akts目的 表达载体中插入片段的序列正确,RT-PCR结果表明将shRNA分别转染HepG2细胞后,Akt的mRNA表达受到明显抑制,其中1shRNA比2#shRNA抑制效果明显.结论 利用Gateway技术成功构建了靶向人Akt基因的shRNA表达载体,为以Akt基因为靶点的肝癌基因治疗方案奠定了实验基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	庄俊华	广东省中医院检验科	153	830	13.0	19.0
2	黄宪章	广东省中医院检验科	192	922	13.0	19.0
3	李曼	广东省中医院检验科	26	100	5.0	8.0
4	何敏	广东省中医院检验科	26	125	6.0	9.0
5	赵学芹	广东省中医院检验科	3	35	3.0	3.0