鸡斑联蛋白基因的慢病毒干扰载体的构建及筛选

• 作者: 孙大辉 孙明明 张跟喜 戴国俊 施会强 林雨鑫 王翔 王金玉 谢恺舟
• 来源期刊: 畜牧兽医学报
• 学科: 农学
• 关键词: zyxin基因 RNAi 慢病毒干扰载体 真核表达载体 鸡
• 年，卷（期）: 2013,（8）
• 所属期刊栏目: 研究简报
• 页码范围: 1330-1336
• 页数: 7页
• 分类号: S813.3
• 字数: 4473字
• 语种: 中文
• DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2013.08.023

摘要

本试验旨在构建4条鸡斑联蛋白(zyxin)基因的RNAi慢病毒载体,对其进行滴度测定,并进行有效干扰靶点的筛选,为以后开展鸡zyxin基因抗球虫机理的研究奠定基础.提取鸡胸腺组织的RNA,反转录,扩增zyxin基因的编码区,并将其克隆到真核表达载体Pex-6上.设计针对zyxin的shRNA序列,应用基因重组技术插入到Lv3慢病毒表达载体中,将lv3-shRNA载体与包装质粒pGag/Pol、pRev、Pvsv-G共转染293T细胞,进行病毒包装.将得到的病毒原液10倍稀释6个梯度,分别转染293T细胞,进行滴度的测定.将构建好的4条慢病毒载体与Pex-6-zyxin真核表达载体共转染293T细胞,运用RT-PCR和Western-blot方法进行有效干扰靶点的筛选.构建4条针对目的基因zyxin的RNAi慢病毒穿梭质粒表达载体CO1、CO2、CO3、CO4和1个阴性对照质粒,经测序鉴定正确;共转染293T细胞包装病毒并浓缩后滴度达1 × 108 TU·mL-1,适合感染目的细胞,经过筛选,CO3对zyxin在293T细胞中的表达干扰效果最佳.成功构建了zyxin基因RNA干扰慢病毒表达载体,并进行了有效干扰靶点的筛选,为进一步研究zyxin基因的功能奠定了基础.