突变型PUMA质粒的构建及表达

• 作者: 万福生 黄伟
• 来源期刊: 安徽医科大学学报
• 学科: 医学
• 关键词: p53上调凋亡调制物 pIRES2-EGFP 定点突变 真核表达载体
• 年，卷（期）: 2013,（4）
• 所属期刊栏目: 基础医学研究
• 页码范围: 341-345
• 页数: 5页
• 分类号: R737.33|R329.2|R394.2
• 字数: 3933字
• 语种: 中文

摘要

目的 构建促凋亡基因p53上调凋亡调制物(PU-MA)的真核表达载体和针对其磷酸化位点定点突变的真核表达载体,为进一步研究其功能奠定基础.方法 通过PCR方法从pCEP4-(HA)2-PUMA质粒中扩增PUMA基因,并克隆到plRES2-EGFP载体上,构建PUMA真核表达载体plRES2-EGFP-(HA)2-PUMA,利用定点突变技术构建pIRES2-EGFP-(HA) 2-PUMA-T28G,行PCR及测序鉴定；脂质体分别将两种质粒转染Hela细胞,同时设未转染的阴性对照组及转染空载体组(4个实验组)；PI染色观察PUMA对细胞的促凋亡作用；流式细胞仪检测细胞凋亡率；RT-PCR检测PUMA的表达；Western blot检测突变型PUMA蛋白和标签蛋白的表达.结果 经PCR及测序结果表明,正确构建野生型、突变型PUMA重组质粒,PUMA基因第10位氨基酸的第28 ～ 30位碱基由丝氨酸(TCC)突变为丙氨酸(GCC),其他碱基均无突变；野生型、突变型PUMA重组质粒转染Hela细胞荧光显微镜观察到绿色荧光,而PI染色观察到野生型、突变型PUMA对Hela细胞的促凋亡作用；流式细胞术检测结果显示突变型和野生型PUMA转染组凋亡率高于阴性对照组和空载体转染组；Western blot和RT-PCR检测出目的基因的高表达.结论 成功构建了PUMA基因及其定点突变载体,为深入研究PUMA基因的抑癌功能及其翻译后调节奠定基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	万福生	南昌大学生物化学与分子生物学教研室	83	491	11.0	18.0
5	黄伟	南昌大学生物化学与分子生物学教研室	36	135	6.0	9.0