重组人凝血因子Ⅷ在昆虫表达系统的分泌表达及鉴定

• 作者: 周岩 孙夏瑜 李杰 武坚锐 郭跃贞
• 来源期刊: 中国优生与遗传杂志
• 学科: 医学
• 关键词: rhFⅧ 血友病 杆状病毒 表达
• 年，卷（期）: 2014,（7）
• 所属期刊栏目: 分子、生化遗传学与PCR技术
• 页码范围: 18-20
• 页数: 3页
• 分类号: R554.11
• 语种: 中文

摘要

目的 克隆人凝血因子Ⅷ (Human Coagulation Factor Ⅷ,rhFⅧ)基因cDNA,利用bac-to-bac杆状病毒表达系统制备具有高凝血活性rhFⅧ.方法 利用PT-PCR和overlap PCR技术扩增人FⅧ基因,亚克隆至转移载体pFastBacHTB,进一步转化至感受态细菌DH10Bac(含穿梭载体Bacmid)中,同源转座、氨苄青霉素及蓝白斑筛选阳性克隆质粒Bacmid/rhFⅧ; PCR法鉴定重组质粒后转染昆虫细胞Sf9;利用病毒感染High five细胞进行蛋白表达,通过SDS-PAGE、Western blot及凝血活性检测方法分析蛋白表达.结果 完成了rBac-rhFⅧ重组杆状病毒的制备,实现了rhFⅧⅡ在昆虫细胞中的重组表达,rhFⅧ相对分子质量为184 kDa左右,SDS-PAGE和Wes tern blot检测结果与预期一致,同时具有良好的促凝血作用.结论 利用杆状病毒-昆虫表达系统成功制备了具有一定促凝血活性的rhFⅧ,为人凝血因子ⅡⅧ进一步的开发及应用奠定了基础.