黑曲霉h408阿魏酸酯酶基因的克隆及在毕赤酵母中的高效表达

• 作者: 侯运华 刘新利 周燕燕 胡泓宇 陈静
• 来源期刊: 微生物学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 阿魏酸酯酶 克隆 表达 黑曲霉
• 年，卷（期）: 2014,（8）
• 所属期刊栏目: 遗传和分子生物学
• 页码范围: 876-881
• 分类号: Q814
• 语种: 中文
• DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.2014.08.004

摘要

[目的]实现在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中高效表达黑曲霉(Aspergillus niger)h408阿魏酸酯酶A基因(AnfaeA),并对重组酶特性进行表征.[方法]采用重叠延伸PCR扩增黑曲霉h408的阿魏酸酯酶A基因.将AnfaeA基因和毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,成功构建重组质粒pPIC9K-Anfae,经线性化后电转化P.pastoris GS115,透明圈法筛选活性高的转化子后进行诱导表达.利用紫外吸收法测定温度及pH对重组阿魏酸酯酶活性的影响.[结果]成功从A.niger h408中克隆得到阿魏酸酯酶A的cDNA基因(GenBank:KF911349),并实现了其在P.pastoris GS115中的高效表达.该基因长度为783bp,含有1个开放阅读框架(ORF),编码260个氨基酸,Blast分析显示该基因和GenBank中黑曲霉阿魏酸酯酶序列同源性为99％.翻译的氨基酸序列含有脂酶典型的活性盖子和催化三联体结构.从转化板上获得1株编号为pPIC9K-Anfae5的转化子阿魏酸酯酶活性最高,酶活达24.72 U/mL,比活力为40.84 U/mg,比黑曲霉出发菌株(22.1 mU/mL)提高了1100倍左右.重组阿魏酸酯酶的最适pH为5.0,且在pH 4.0-9.0稳定性较好;最适反应温度50℃,在40-60℃时较稳定.[结论]阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的高效分泌表达为其在饲料工业和造纸工业等工业化应用提供了前提,也为后续改进酶学特性的定向进化奠定实验基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	刘新利	齐鲁工业大学食品与生物工程学院	40	153	6.0	11.0
2	侯运华	齐鲁工业大学食品与生物工程学院	6	22	3.0	4.0
3	周燕燕	齐鲁工业大学食品与生物工程学院	4	17	3.0	4.0
4	陈静	齐鲁工业大学食品与生物工程学院	7	18	2.0	4.0
5	胡泓宇	齐鲁工业大学食品与生物工程学院	2	10	2.0	2.0