靶向G蛋白偶联受体91的小发夹RNA慢病毒载体的构建及功能初步检测

• 作者: 吴强 李婷婷 胡健艳
• 来源期刊: 眼科新进展
• 关键词: 小发夹RNA 慢病毒属 G蛋白偶联受体91 糖尿病性视网膜病变 血管内皮生长因子
• 年，卷（期）: 2014,（8）
• 所属期刊栏目: 实验研究
• 页码范围: 705-709
• 页数: 5页
• 字数: 5356字
• 语种: 中文
• DOI: 10.13389/j.cnki.rao.2014.0193

摘要

目的 构建靶向大鼠G蛋白偶联受体91(G protein-coupled receptor 91,GPR91)基因的小发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体,探讨GPR91受体对高糖诱导下血管内皮生长因子(vascular endothlial growth factor,VEGF)释放的调节作用.方法 设计合成4对针对大鼠GPR91(NM_001001518)的特异性单链寡核苷酸链,两端分别引入Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点,退火后得到小片段带黏性末端的双链DNA,克隆入慢病毒载体pGCSIL-GFP,行聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和DNA测序鉴定重组体.将各慢病毒shRNA干扰载体和辅助包装载体共转染293T细胞,收集病毒颗粒并行浓缩滴度检测.将各慢病毒载体转染RGC-5细胞后,Western blot法筛选有效的慢病毒shRNA干扰载体.使用45 mmol· L-1的高糖刺激RGC-5细胞24 h,用ELISA法观察干扰GPR91后VEGF的表达情况.结果 PCR及DNA测序结果均显示慢病毒载体pGCSIL-GFP-shGPR91构建正确;包装病毒颗粒后,pGCSIL-GFP-shGPR91-1、2、3、4组病毒浓缩液的滴度依次为1.5×109 TU·mL-1、1.5×109 TU·mL-1、3.0×109 TU·mL-1、3.0×109 TU · mL-.将慢病毒颗粒感染RGC-5细胞后,Western blot检测显示NC组GPR91蛋白(0.60±0.08)空白组(0.62±0.07)的表达无明显差异(F =49.03,P＞0.05).而与空白组相比,4个慢病毒载体组(0.48±0.05、0.34±0.06、0.30±0.04和0.11±0.06)均能不同程度沉默GPR91的表达,差异有统计学意义(F=49.03,P＜0.01),其中pGCSIL-GFP-shGPR91-3干扰效率最高.ELISA结果显示空白组、高糖组、高糖+NC组、高糖+pGCSIL-GFP-shG-PR91-3组VEGF蛋白表达分别为(25.63±4.52) pg·mL-、(72.74±8.24) pg·mL-、(71.68±8.31)pg· mL-1和(46.77±6.21)pg·mL-1,表明GPR91病毒干扰载体可显著降低高糖引起的VEGF分泌,差异有统计学意义(F=30.852,P＜0.01).结论 本实验成功构建了靶向大鼠GPR91的shRNA慢病毒载体并进行病毒颗粒包装.所构建的慢病毒载体能够降低高糖作用下的VEGF表达,为进一步研究GPR91基因在糖尿病视网膜病变中的作用机制和动物基因治疗奠定基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	吴强	上海交通大学附属第六人民医院眼科	138	590	11.0	15.0
2	李婷婷	苏州大学医学部	15	32	3.0	5.0
3	胡健艳	上海交通大学附属第六人民医院眼科	10	43	3.0	6.0