水貂 IFN-α、IFN-β及 IFN-γmRNA 荧光定量RT-PCR 检测方法的建立及应用

• 作者: 凌明玉 刘昊 史宁 吕爽 孙彦刚 张海玲 张蕾 徐淑娟 李欣彤 王洋 白雪 胡博 范思宁 薛向红 赵建军 闫喜军 马凡舒 鲁荣光
• 来源期刊: 动物医学进展
• 学科: 农学
• 关键词: SYBR GreenⅠ 实时荧光定量PCR 水貂 α干扰素 β干扰素 γ干扰素
• 年，卷（期）: 2015,（11）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 1-6
• 页数: 6页
• 分类号: S852.4
• 字数: 4173字
• 语种: 中文

摘要

为采用SYBR GreenⅠ染料建立检测水貂IFN-α、IFN-β和IFN-γmRNA荧光定量RT-PCR检测方法，根据 GenBank 中登录的 MiIFN-α和 MiIFN-β、MiIFN-γ和3-磷酸甘油脱氢酶（GAPDH）基因序列，分别设计合成特异性引物，通过 RT-PCR 扩增 MiIFN-α、MiIFN-β、MiIFN-γ和 MiGAPDH 的基因片段，构建到 pMD18-T 载体中制备质粒标准品，建立了相应基因 mRNA 的荧光定量 RT-PCR 检测方法并建立标准曲线。结果表明，MiGAPDH、MiIFN-α和 MiIFN-β和 MiIFN-γ基因的 Ct 值与标准品稀释度在10拷贝质粒／μL ～107拷贝质粒／μL 内均呈良好的线性关系，相关系数（R2）均为1．00，熔解曲线均呈单一熔解峰，检测下限为10拷贝质粒／μL，重复性试验表明组内、组间变异系数均小于4．5％。临床样品检测结果表明水貂感染肠炎病毒后，MiIFN-α、MiIFN-β和 MiIFNγ相对表达水平均在6 d 达到最高峰值，MiIFN-α相对表达量要比 MiIFN-β和 MiIFN-γ相对表达量高两个数量级，并且在感染期（4 d～6 d）MiIFN-α相对表达量明显提高。本研究为水貂 IFN mRNA 的定量分析提供了有效工具。