应用易错PCR技术提高环糊精葡萄糖基转移酶的可溶性表达

• 作者: 林新坚 蔡海松 贾宪波 郭永华 陈济琛 陈龙军
• 来源期刊: 微生物学报
• 关键词: 嗜热环糊精葡萄糖基转移酶 可溶性表达 定向进化 易错PCR
• 年，卷（期）: 2016,（10）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 1551-1560
• 语种: 中文
• DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20150602

摘要

[目的]对嗜热脂肪芽孢杆菌CHB1的环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)基因进行定向进化,筛选得到胞外酶活性和可溶性表达定量提高的突变酶.[方法]采用易错PCR技术向环糊精葡萄糖基转移酶基因中随机引入突变,建立酶基因突变文库,筛选获得胞外酶活性和可溶性表达定量提高的突变体,并对突变酶进行诱导表达、纯化及部分酶学性质研究.[结果]通过筛选获得CGTase胞外酶活性和可溶性表达定量提高的突变菌株ds-6和ep-9,其胞外α-环化活力分别是原始酶的1.72倍和2.18倍,可溶性表达量提高了1倍.序列分析表明,突变体ep-9有3个碱基发生了变化:G2005A/A2037G/T2081G,其中有2个碱基突变导致了氨基酸的改变.SWISS-MODEL数据库模拟CGTase的结构表明,2个突变氨基酸分别位于无规卷曲和β-转角/折叠之间的转角中.酶学性质测定表明:突变CGTase的β-环化比活力是原始酶的2.44倍,总环化比活力提高了34％,Km值由4.3 g/L降低到3.74 g/L;在pH稳定性方面较原始酶有所提高.单碱基定点突变证实突变体ep-9可溶性表达水平及胞外酶活性提高的关键突变是G2005A.[结论]本试验表明:基于易错PCR技术获得嗜热芽孢杆菌CHB1的CGTase的胞外酶活和可溶性表达定向进化,G2005A突变对于提高CGTase的可溶性表达及胞外酶活起关键作用,这对认识CGTase的构效关系以及进一步改造该酶分子、扩大酶的生产应用具有重要意义.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	陈济琛	福建省农业科学院土壤肥料研究所	88	786	15.0	23.0
2	蔡海松	福建省农业科学院土壤肥料研究所	41	318	10.0	15.0
3	郭永华	福建省农业科学院土壤肥料研究所	2	3	1.0	1.0
7	贾宪波	福建省农业科学院土壤肥料研究所	8	8	2.0	2.0
11	陈龙军	福建省农业科学院土壤肥料研究所	12	21	3.0	3.0