一种能实现蛋白可逆表达的敲入载体构建方法

• 作者: 张梅英 徐影琪 杨葳 王金霞 郑志红 魏政立
• 来源期刊: 辽宁农业科学
• 学科: 生物学
• 关键词: FKBP(L106P)不稳定结构域(DD-C) Shield1 敲入载体 重叠延伸 PCR 可逆降解
• 年，卷（期）: 2016,（4）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 27-32
• 页数: 6页
• 分类号: Q813.6
• 字数: 5497字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1002-1728.2016.04.006

摘要

在细胞或小鼠中使用 Cre重组酶（Cyclization Recombination Enzyme，即环化重组酶）条件性地删除或修饰基因是不可逆的，基因删除后蛋白不能恢复表达。FK506-雷怕霉素结合蛋白 FKBP L106P 不稳定结构域（FKBP L106P destabilization domain）DD-C -Shield1系统可以解决这个问题，能人为控制蛋白表达或降解，避免胚胎致死。本实验以小 GTP 酶腺苷二磷酸核糖基化因子6（ADP-ribosylation factor 6，ARF6）为例，借助 EL350细菌中 Red／ET重组作用，使用 DD-C-Shield1系统和重叠延伸 PCR方法，发展一种通用的可实现蛋白可逆表达的构建敲入载体的方法。该方法缩短了构建时间，减少了重组的步骤，不需要使用 rpsL-neo DNA、链霉素和酶切位点。此敲入载体两侧同源臂5 kb左右，可用传统的 ES 打靶方法构建敲入小鼠，经过简单改造也可使用 CRISPR／Cas9方法构建敲入细胞或小鼠模型，从而在细胞和动物模型中进行条件性修饰、快速、可逆地调节特异性蛋白表达，以利于发育学研究，为细胞和活体生物严谨调控蛋白功能提供了一种新的策略。