Ku70基因稳定敲除HeLa细胞株的建立及其生物学功能研究

• 作者: 丁红梅 张坦 李少华 李慧 李达 沈雪莲 王超男 白琛俊 耿介 董洁 邵宁生 黄皑雪
• 来源期刊: 生物技术通讯
• 学科: 生物学
• 关键词: CRISPR/Cas9技术 基因敲除 同源重组 Ku70基因 HeLa细胞
• 年，卷（期）: 2018,（2）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 155-161
• 页数: 7页
• 分类号: Q78
• 字数: 4535字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1009-0002.2018.02.001

摘要

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建人Ku70基因稳定敲除的HeLa细胞株,并检测其生物学功能.方法:设计并构建向导RNA载体pCas-gRNA和同源重组供体DNA载体pBackZero-T-Ku70,2种重组质粒共转染HeLa细胞,加入潮霉素B进行抗性筛选,通过基因组PCR和Western印迹检验Ku70基因是否被敲除;进而,选择Ku70稳定敲除的细胞株,分别采用CCK-8和Transwell实验检测细胞增殖和迁移能力;此外,提取细胞总RNA,反转录成cDNA后用荧光定量PCR仪检测5种miRNA(hsa-miR-649、hsa-miR-544a、hsa-miR-562、hsa-miR-548a、hsa-miR-492)的表达水平.结果:gRNA表达质粒pCas-gRNA和DNA供体质粒pBackZero-T-Ku70构建成功;2种重组质粒共转染HeLa细胞,基因组PCR扩增出特异的基因重组DNA片段,Western印迹结果显示Ku70蛋白已基本无表达.细胞增殖和迁移实验显示敲除Ku70基因的HeLa细胞增殖和迁移能力均有所减弱.qRT-PCR结果显示,敲除Ku70基因致hsa-miR-649、hsa-miR-544a和hsa-miR-562水平有所升高,而hsa-miR-548a和hsa-miR-492水平未有明显变化.结论:获得Ku70基因稳定敲除的细胞株;Ku70蛋白可能参与了HeLa细胞增殖和迁移过程;其还可能调节部分miRNA的表达.