利用CRISPR／Cas方法建立RNase L基因稳定敲除细胞株

• 作者: 付汉江 朱捷 李瑞花 沈远 郑晓飞 钟一然
• 来源期刊: 军事医学
• 学科: 生物学
• 关键词: CRISPR/Cas技术 RNase L 小鼠,基因敲除 同源重组 内切核糖核酸酶类 转染 潮霉素B
• 年，卷（期）: 2015,（10）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 742-746
• 页数: 5页
• 分类号: Q784|Q556
• 字数: 4678字
• 语种: 中文
• DOI: 10.7644/j.issn.1674-9960.2015.10.003

摘要

目的：利用CRISPR／Cas9技术建立人RNase L基因稳定敲除的细胞株。方法根据GenBank中RNase L基因序列，设计RNase L敲除的小指导RNA（ sgRNA）序列，将其克隆到pCas-Guide真核表达载体中，获得pCas指导RNA（ gRNA）载体；设计供体DNA的同源臂序列，通过搭桥PCR将左同源臂、潮霉素B抗性基因和右同源臂扩增成为一条片段作为同源重组的修复模板，并将其克隆到pBackZero-T表达载体上，获得pBackZero-T-RNase LK载体。将上述两个载体共转染HEK293细胞，用潮霉素B筛选，通过Western印迹和DNA测序等技术验证RNase L从基因组上敲除。结果与结论成功构建了载体pCas-gRNA和pBackZero-T-RNase LK，Western印迹和DNA测序结果表明，成功获得5株RNase L缺失的细胞株，为探讨RNase L的生物学功能和研究其分子机制奠定了基础。