玉兰盐胁迫下qRT-PCR分析中内参基因的筛选

• 作者: 俞芹 卞赛男 宣铃娟 常鹏杰 张超 王型力 王宁杭 王小德 申亚梅 范李杰 董彬
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: 玉兰 内参基因 盐胁迫 组织
• 年，卷（期）: 2018,（9）
• 所属期刊栏目: 研究资源与技术改进
• 页码范围: 1611-1620
• 页数: 10页
• 分类号: S-3|Q94-336
• 字数: 4998字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2018.09.015

摘要

选择合适的内参基因可以提高qRT-PCR分析相关基因表达的准确性.本研究以玉兰(Magnolia denudata)实生苗在盐胁迫下的根、茎、叶为材料,选取常用的13个内参基因:肌动蛋白(actin,ACTIN)、亲环蛋白(cyclophilin,CYP)、延伸因子1α蛋白(elongationfactors-1α,EF-1α)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphat dehydrogenase,GAPDH)、GTP结合蛋白(GTP binding protein,GBP)、NAC域蛋白(NAC domain protein,NAC)、异柠檬酸脱氢酶(NADP-isocitrate dehydrogenase,NADP)、翻译延伸因子(translation elongation factors,TEF)、泛素化酶基因(ubiquitin-conjugating enzyme,UBC)、多聚泛素蛋白(polyubiquitin protein,UBQ)、微管蛋白(α-tubulin alphaα,α-TUB)、β微管蛋白(tubulin beta,β-TUB)、18S核糖体RNA(18S ribosomal RNA,18S)作为候选内参基因,设计引物,通过普通PCR和溶解曲线验证引物特异性;结合geNorm、NormFinder和BestKeeper软件分析筛选最佳内参基因,进一步通过2个目的基因:纤维素合成酶类似蛋白D(cellulose synthase-like D,CSLD)和l,4-β-d-葡聚糖酶(endo-1,4-beta-d-glucanase,KOR)对筛选得到的内参基因进行验证.结果显示,13个内参基因PCR产物条带清晰单一,引物扩增效率均在95％到105％之间,且溶解曲线呈现明显的单一峰,表明引物特异性良好;3个内参软件geNorm、NormFinder和BestKeeper综合分析得到稳定性排名前3的内参基因为GBP、UBQ和UBC,而18S为最差的内参基因.进一步选取GBP、UBQ、UBC 3个基因的组合以及稳定性差的18S和GAPDH基因,对不同组织中的CSLD和KOR基因进行相对表达分析,结果表明,两个目的基因相对于3个稳定的内参基因及其组合显示出一致的相对表达量,而不稳定的内参基因18S和GAPDH没有对表达数据进行有效的标准化,结果存在偏差.由此可见,GBP、UBQ和UBC可以作为玉兰盐胁迫下不同组织器官中表达的稳定内参.本研究结果将为木兰属植物在逆境中相关目的基因的定量表达研究提供重要的参考依据.