番茄褪绿病毒实时荧光定量PCR检测技术的建立

• 作者: 丁天波 刘晓蓓 李洁 褚栋 魏可可
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 番茄褪绿病毒 实时荧光定量PCR 烟粉虱 检测
• 年，卷（期）: 2018,（10）
• 所属期刊栏目: 研究简报
• 页码范围: 2013-2022
• 页数: 10页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2018.10.020

摘要

[目的]建立一种实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)检测番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)的方法,用于测定田间植株样品及其传毒媒介烟粉虱(Bemesia tabaci)中ToCV的含量.[方法]首先根据ToCV次要外壳蛋白(minor coat protein,CPm)基因的保守区域序列,运用Primer 3.0在线软件设计ToCV特异性检测引物ToCVqF和ToCVqR,并通过Primer-BLAST进行比对保证检测引物的特异性;其次分别以感染ToCV、番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)的番茄样品为模板,应用该对引物进行ToCV基因片段的克隆鉴定;将阳性克隆样品放入含有氨苄青霉素的LB液体培养基中扩大培养,并提取质粒,获得ToCV质粒标准品,将ToCV质粒标准品按10倍浓度梯度稀释,建立标准曲线;同样以按1 0倍浓度梯度稀释的ToCV质粒标准品为模板,同时运用RT-qPCR和反转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR),比较这两种方法检测ToCV的灵敏度;最后应用该方法对田间采集的8份疑似ToCV感染的番茄样品以及获毒24 h后的单头烟粉虱进行病毒检测,结合扩增曲线、熔解曲线和Ct值对待测样品中的带毒情况和带毒量进行测定.[结果]在感染ToCV的番茄样品和阳性对照中,引物ToCVqF和ToCVqR均能够特异扩增出ToCV CPm基因片段,目的片段大小为230 bp,而在感染TYLCV、TSWV的番茄样品、健康番茄样品和空白对照中,该对引物则无法扩增出特异性目的条带,说明该对引物特异性较强;构建ToCV的RT-qPCR标准曲线结果表明,随着ToCV质粒标准品模板浓度逐渐降低,Ct值出现递增趋势,并且在质粒标准品浓度2.7×103-2.7×109 copies/μL范围内,ToCV标准曲线Ct值同质粒标准品浓度之间呈现良好的线性关系,扩增效率为100％,决定系数R2=0.9911,直线方程为y=-3.32×lgx+40.06(y代表循环阈值即Ct值,x代表质粒初始浓度),该曲线将用于ToCV含量的测定.RT-qPCR灵敏度检测结果表明,该方法能够检测出的ToCV质粒标准品最低浓度为2.7×103copies/μL,而常规RT-PCR仅能够检测出2.7×105 copies/μL的病毒样品,通过RT-qPCR法检测ToCV比常规RT-PCR法灵敏100倍.该方法能成功检测出田间植物样品携带ToCV情况,8份疑似ToCV感染的番茄样品中有6份携带ToCV,同常规RT-PCR检测结果一致,结合标准曲线计算出感染ToCV的番茄样品带毒量分别为2.48×105、2.21×105、7.97×104、3.74×107、3.37×107、2.78×106 copies/μL;烟粉虱获毒24 h后,携毒率为100％,单头烟粉虱最高带毒量为2.55×104 copies/μL,最低为6.46×102copies/μL.[结论]建立的RT-qPCR检测ToCV的方法特异性强、灵敏度高,可以实现植物样品和媒介昆虫携带ToCV情况和病毒含量的检测,可为ToCV的准确、有效监测和预警提供技术支持.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	褚栋	青岛农业大学植物医学学院山东省植物病虫害综合防控重点实验室	25	200	9.0	13.0
2	丁天波	青岛农业大学植物医学学院山东省植物病虫害综合防控重点实验室	6	37	4.0	6.0
3	刘晓蓓	青岛农业大学植物医学学院山东省植物病虫害综合防控重点实验室	1	4	1.0	1.0
4	李洁	青岛农业大学植物医学学院山东省植物病虫害综合防控重点实验室	6	35	4.0	5.0
5	魏可可	青岛农业大学植物医学学院山东省植物病虫害综合防控重点实验室	2	16	2.0	2.0