棉铃虫磷脂酰乙醇胺结合蛋白的克隆及表达分析

• 作者: 任苏伟 刘宁 刘小宁 艾新宇 赵洁 马纪
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 棉铃虫 磷脂酰乙醇胺结合蛋白 原核表达 时空表达 2-十三烷酮
• 年，卷（期）: 2018,（8）
• 所属期刊栏目: 植物保护
• 页码范围: 1493-1503
• 页数: 11页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2018.08.007

摘要

[目的]克隆获得棉铃虫(Helicoverpa armigera)磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine binding protein,PEBP)的cDNA序列,分析HaPEBP在棉铃虫体内的表达规律,检测2-十三烷酮处理条件下棉铃虫体内HaPEBP的变化情况,为进一步明确棉铃虫PEBP的功能和选择该基因作为调控棉铃虫种群数量的分子靶标提供依据.[方法]利用RACE技术从棉铃虫6龄幼虫的中肠组织中扩增得到HaPEBP的cDNA序列,并对其氨基酸序列和蛋白结构进行分析.将HaPEBP的ORF序列连接至pET32a载体并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后检测目的蛋白的表达形式,并通过镍柱的亲和层析纯化融合蛋白.最后通过实时荧光定量PCR检测棉铃虫幼虫不同时期和6龄幼虫不同组织中HaPEBP的表达规律,以及2-十三烷酮处理棉铃虫6龄幼虫后中肠内HaPEBP的变化规律.[结果]获得的HaPEBP cDNA序列长760 bp,其中ORF为588 bp,编码195个氨基酸,蛋白质分子量和等电点分别为21.76 kD和5.93.氨基酸序列分析表明HaPEBP无信号肽、跨膜结构域和二硫键,是一个由4个α螺旋和9个 β 折叠片组成的胞质单体蛋白.将BL21(DE3)-pET32a-HaPEBP重组菌用1 mmol·L-1的IPTG在37℃条件下诱导4 h,约40 kD的融合蛋白His-HaPEBP能以可溶的形式存在于重组菌中.按照同样的方法诱导1 L的重组菌,将超声处理后的上清液与Ni-NTA柱结合,进行咪唑缓冲液梯度洗涤,200 mmol·L-1的咪唑洗涤两次后得到约40 kD的单一蛋白,与融合蛋白的大小一致.将此流出液超滤浓缩,获得183.3 ng·μL-1的融合蛋白,能被抗His-Tag的单克隆抗体识别发生免疫反应.HaPEBP在棉铃虫幼虫的1—6龄期和预蛹期均表达,且6龄幼虫的表达量最高.该基因在6龄幼虫的脂肪体、中肠、头部和体壁中也均有表达,且脂肪体内的表达量最高.不同浓度的2-十三烷酮处理后,棉铃虫6龄幼虫中肠内HaPEBP的表达量均有所降低;低浓度(2.5和5 mg·g-1)在6 h就能降低HaPEBP的表达量,其mRNA含量随着时间的延长逐渐增加;而高浓度(10和15 mg·g-1)在12 h才会降低HaPEBP的表达量,其mRNA含量随着时间的延长先下降后上升.[结论]克隆分析了HaPEBP,利用大肠杆菌系统表达出可溶的融合蛋白His-HaPEBP,并通过镍柱-咪唑纯化法得到了高纯度的融合蛋白,时空表达分析显示HaPEBP在棉铃虫6龄幼虫和脂肪体中表达量最高,2-十三烷酮处理6龄幼虫后中肠内HaPEBP的表达量显著降低.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	马纪	新疆大学生命科学与技术学院	80	657	14.0	23.0
2	刘小宁	新疆大学生命科学与技术学院	45	144	6.0	10.0
3	赵洁	新疆大学生命科学与技术学院	12	15	2.0	3.0
4	任苏伟	新疆大学生命科学与技术学院	4	3	1.0	1.0
5	刘宁	新疆农业科学院农作物品种资源研究所	4	12	2.0	3.0
6	艾新宇	新疆大学生命科学与技术学院	6	3	1.0	1.0