FANCJ在HEK293T细胞中的表达 、纯化及活性检测

• 作者: 储小玲 刘松柏 吴洁 撖荣 杜佳慧 杨凡 苏倩 薛胜利 袁濮玉 邱桥成
• 来源期刊: 重庆医学
• 学科: 生物学
• 关键词: FANCJ 突变体 蛋白纯化 活性检测
• 年，卷（期）: 2018,（36）
• 所属期刊栏目: 论著·基础研究
• 页码范围: 4584-4587
• 页数: 4页
• 分类号: Q814.1
• 字数: 3280字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1671-8348.2018.36.006

摘要

目的 构建包含FANCJ野生型(wt)及其突变体N196S蛋白的真核表达载体,并对纯化的野生型蛋白及突变体蛋白进行活性检测.方法 从HEK293T中提取RNA,并反转录为cDNA,使用带有3xFlag标签序列的特异性引物通过PCR方法扩增出人FANCJ编码区全长,并克隆到plvx-EF1-MCS-PGK-PURO载体上;突变体N196S利用NEBaseChangerTM引物设计工具,并利用NEB公司的点突变构建试剂盒Q5?Site-Directed Mutagenesis Kit技术进行操作.重组的FANCJ及突变体N196S表达质粒通过脂质体polyJet转染到HEK293T细胞中进行表达.使用免疫沉淀及竞争洗脱的方法纯化FANCJ及N196S突变体蛋白.利用荧光标记DNA底物的方法检测FANCJ及N196S突变体蛋白的DNA解旋酶活性.结果 FANCJw t基因及N196S突变体全长编码序列成功构建到plvx-EF1-MCS-PGK-PURO载体上,蛋白质印迹法(Western blot)及PAGE胶银染方法成功检测到了FANCJwt及N196S突变体蛋白的表达 、纯化,荧光标记Oligo DNA底物方法发现FANCJwt与N196S突变体蛋白DNA解旋酶活性存在差异.结论 成功构建了FANCJwt及N196S突变体真核表达载体,通过生化实验发现FANCJ及N196S突变体蛋白存在差异的DNA解旋酶活性.