构建EIF5 A2基因敲除Cal27细胞株及功能分析

• 作者: 刘娜 刘艳艳 汪育苗 王凤光 胡晔华 袁晓红
• 来源期刊: 北京口腔医学
• 学科: 医学
• 关键词: EIF5A2 CRISPR/Cas9 口腔鳞状细胞癌 基因敲除 迁移
• 年，卷（期）: 2019,（1）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 15-19
• 页数: 5页
• 分类号: R349.6
• 字数: 4520字
• 语种: 中文

摘要

目的 运用CRISPR/Cas9技术构建EIF5A2基因敲除Cal27细胞系,观察EIF5A2在口腔鳞状细胞癌增殖与迁移中的作用.方法 根据EIF5A2基因结构域,设计2个CRISPR靶向位点,利用pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin构建2个导向RNA(sgRNA)质粒.将sgRNA质粒与pST1374-NLS-flag-linker-Cas9共转染至Cal27细胞中,用嘌呤霉素和杀稻瘟菌素筛选,并挑取单克隆.将单克隆细胞的DNA进行目的片段扩增,经凝胶电泳及测序鉴定后筛选出大片段敲除细胞株Cal27-2C5及碱基突变株Cal27-2D1.real time PCR及WesternBlot鉴定两株细胞系中EIF5A2的表达情况.用Transwell实验及CCK8分别检测EIF5A2敲除对Cal27细胞的体外迁移能力及体外增殖能力的影响.结果 与对照组相比,Cal27-2C5及Cal27-2D1细胞株中EIF5A2在mRNA水平上表达均明显降低.在蛋白水平上,Cal27-2C5及Cal27-2D1细胞株中EIF5A2蛋白均基本不表达.敲除EIF5A2可明显降低Cal27细胞的体外迁移能力,而对Cal27细胞体外增殖能力没有明显影响.结论 成功构建EIF5A2基因敲除Cal27细胞株Cal27-2C5和Cal27-2D1,并初步验证EIF5A2可以影响Cal27细胞的体外迁移能力.