α2B-肾上腺素能受体与增强型绿色荧光蛋白标记的活化T细胞核因子2共表达稳转细胞株的构建

• 作者: 傅风华 周培岚 李玉蕾 王震 苏瑞斌
• 来源期刊: 中国药理学与毒理学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 肾上腺素能受体,α2 NFAT转录因子类 核转位实验 右美托咪啶
• 年，卷（期）: 2019,（2）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 116-122
• 页数: 7页
• 分类号: R964
• 字数: 6220字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3867/j.issn.1000-3002.2019.02.005

摘要

目的 建立能够稳定表达α2B-肾上腺素能受体(α2B-AR)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的活化T细胞核因子2(NFAT2)(EGFP-NFAT2)的稳转细胞株.方法 构建具有潮霉素(Hydro)抗性的pcDNA3.1α2B-AR重组质粒(pcDNA3.1-Hygro-α2B-AR),转染至表达EGFP-NFAT2的U2OS细胞(U2OS-EGFP-NFAT2细胞),使用Hygro 200 mg·L-1压力筛选10 d后,进行NFAT2核转位实验筛选细胞株并用Z'因子法评价细胞模型的可靠性,采用实时定量PCR和Western蛋白印迹法,检测α2B-AR的mRNA和蛋白表达水平,选择α2-AR的激动剂盐酸右美托咪啶(DMED)和拮抗剂盐酸阿替美唑(ATI)通过NFAT2核转位实验评价α2B-AR的功能活性.结果 成功构建重组质粒pcDNA3.1-Hygro-α2B-AR后,稳定转染至U2OS-EGFP-NFAT2细胞,采用NFAT2核转位实验筛选发现,编号12的细胞株相对核转位指数为0.445,活性最高;3次独立实验中,Z'因子分别为0.664,0.533和0.634.实时定量PCR结果显示,编号12的细胞株α2B-AR mRNA表达水平是U2OS-EGFP-NFAT2细胞株的140倍,表达显著增加(P<0.01),且在20代次内表达稳定.Western蛋白印迹结果显示,编号12的细胞株出现明显的α2B-AR蛋白条带,而U2OS-EGFP-NFAT2细胞中未检测到α2B-AR蛋白表达.DMED可以浓度依赖性地提高该细胞株的核转位水平〔EC50=(2.616±0.121)nmol·L-1〕,ATI可以浓度依赖性地对抗DMED的作用〔IC50=(89.05±0.22)nmol·L-1〕.结论 成功构建了共表达α2B-AR与EGFP-NFAT2的稳转细胞株,可用于靶向α2B-AR化合物的筛选和受体分子机制的研究.