人CREG启动子报告基因质粒的构建及转录活性分析

• 作者: 刘丹 刘姗 刘美丽 刘艳霞 田孝祥 闫承慧
• 来源期刊: 解放军医学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: E1A激活基因阻遏子 转录启动子 报告基因质粒 绿色荧光蛋白质类 聚合酶链反应
• 年，卷（期）: 2019,（7）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 585-592
• 页数: 8页
• 分类号: R331
• 字数: 5782字
• 语种: 中文
• DOI: 10.11855/j.issn.0577-7402.2019.07.09

摘要

目的 构建人E1A激活基因阻遏子基因(hCREG)不同截短片段的启动子增强型绿色荧光蛋白(pEGFP1)报告基因载体,比较各启动子转录活性,从而确定hCREG核心启动子区.方法 通过查询美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库hCREG序列并结合启动子特点,获得长度为2003(–1925/+78)bp的启动子片段.利用PCR法及双酶切法截短5个启动子片段并克隆至pEGFP1中,构建pEGFP1_hCREG_2003、pEGFP1_hCREG_945、pEGFP1_hCREG_586、pEGFP1_hCREG_478、pEGFP1_hCREG_358报告基因载体质粒.并将其与内参质粒pGL4.73[hRluc/SV40]瞬时共转染入293T细胞48 h,荧光显微镜下观察pEGFP1_hCREG启动子报告基因的绿色荧光表达;采用实时定量PCR检测各启动子mRNA的表达,并确定核心启动子区.采用生物信息学方法预测核心启动子区可能结合的转录因子.结果 通过双酶切和基因测序法证实成功构建5个hCREG启动子报告基因载体.荧光显微镜下的观察结果和实时定量PCR结果均显示,pEGFP1_hCREG_586转录活性最高(P<0.05),pEGFP1_hCREG_358转录活性最低(P<0.05),pEGFP1_hCREG_2003、pEGFP1_hCREG_945、pEGFP1_hCREG_478转录活性差异均无统计学意义(P>0.05),提示–867/–509 bp为负性调控区,–400/–281 bp和–508/–401 bp均存在增强子序列,故hCREG基因核心启动子区位于基因5'上游序列–508/–281 bp区域.生物信息学预测关键启动子区–508/–281 bp可能结合的转录因子为Pax5/P53、C/EBPβ、GR-β、GATA-1、GR-α、c-Jun、PRB/PRA、YY1、RXR-α、AP-2、FOXP3、GR、TFIID、STAT4、c-Ets-1.结论 成功构建了hCREG基因启动子重组质粒,其核心启动子位于–508/–281 bp区域,此区域可结合多个转录因子.