小鼠ERO1α基因慢病毒干扰载体的构建与鉴定

• 作者: 刘婉洋 屈玉杏 戴安娜 胡佳慧 许显玉 陈风雷
• 来源期刊: 动物医学进展
• 学科: 农学
• 关键词: 内质网氧化还原酶1α 慢病毒载体 shRNA
• 年，卷（期）: 2019,（11）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 28-35
• 页数: 8页
• 分类号: S852.65
• 字数: 5928字
• 语种: 中文

摘要

针对小鼠ERO1α基因构建短发卡RNA(Short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体.根据NCBI中小鼠ERO1α基因序列,设计3条针对ERO1α的shRNA序列和1条阴性对照shRNA序列.将shRNA序列连接到慢病毒载体pCD513B-U6上,同时进行PCR鉴定及测序,分别命名为pCD513B-ERO1α-shRNA和pCD513B-NC-shRNA.将构建好的重组质粒和包装辅助质粒共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒.将所得病毒悬液进行浓缩,同时梯度稀释转导HEK 293T细胞,检测病毒滴度.浓缩后的慢病毒转导RAW 264.7细胞,通过RT-qPCR和Western blot技术进行有效片段的筛选.之后,将筛选的慢病毒转到多种细胞系或者原代细胞,用RT-qPCR和Western blot技术检测ERO1α基因的表达情况.PCR及测序结果表明,重组慢病毒干扰载体pCD513B-ERO1α-shRNA构建成功,所包装的慢病毒其病毒滴度为5×107 TU/mL～10×107 TU/mL.RT-qPCR和Western blot结果表明,pCD513B-ERO1α-shRNA-3抑制ERO1α表达的效果最好,干扰效率在80％左右.pCD513B-ERO1α-shRNA-3能够转导多种细胞,并显著抑制ERO1α的表达,干扰效率在70％～90％.成功构建针对小鼠ERO1α基因的shRNA重组慢病毒载体,为进一步研究ERO1α功能奠定了技术基础.