基于CRISPR/Cas9技术的miR-374a低表达细胞系的构建及鉴定

• 作者: 周育森 寇志华 方军 李军锋 李崇慧 李浩 谢柱 陈佳唯
• 来源期刊: 蚌埠医学院学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 微小RNA-374a 转化生长因子 CRISPR/CAS9技术 细胞增殖
• 年，卷（期）: 2019,（5）
• 所属期刊栏目: 基础医学
• 页码范围: 561-565
• 页数: 5页
• 分类号: Q78
• 字数: 4276字
• 语种: 中文
• DOI: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2019.05.001

摘要

目的:运用CRISPR/Cas9技术构建miR-374a低表达细胞系.方法:设计针对miR-374a成熟体gRNA,合成DNA,插入pSpCas9(BB)-2A-Puro,将鉴定正确的载体转染入肺癌细胞系A549细胞,使用嘌呤霉素筛选转染的细胞;PCR方法扩增,序列测定分析细胞基因组中靶位点区域序列;定量PCR方法检测转染细胞中miR-374a及其靶基因TGFA的表达情况;细胞增殖实验检测miR-374a基因编辑对细胞生长情况的影响.结果:构建了靶向miR-374a成熟体基因序列的基因编辑载体,转染细胞经过加压筛选,序列分析结果提示靶向位点的基因发生了缺失或插入突变;定量PCR结果显示,转染基因编辑载体的细胞miR-374a表达水平较对照细胞明显下降(P<0.01),而靶基因TGFA表达则明显上升(P<0.05);细胞增殖实验显示miR-374a低表达的细胞增殖能力发生了明显改变(P<0.05～P<0.01).结论:成功构建了miR-374a低表达细胞系,为后续研究该分子的功能提供了基础.